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你好，上游酶切位点后面面添加Kozak序列是为了提高蛋白编码基因真核细胞表达的效率，主要是提高翻译效率。换句话讲，如果做过表达质粒转染后发现mRNA水平有显著提高，而蛋白表达不变或上升不明显，则考虑添加Kozak sequence。你说后面加上ATG启动子，这个我不明白，ATG是起始密码子，是包含在CDS中的，启动子是在你的质粒上酶切位点的上游的。 然后下游引物加FLAG，FLAG是个标签蛋白，你根据自己的实验需求看是否需要，可以加5’，也可以3′ 有问题可以再一起交流