罕见出血性疾病的诊断

1 介绍

在2018年世界血友病联盟的全球调查中，14%的患者被记录为患有血友病或血管性血友病以外的出血性疾病（wfh.org）。这一数字与1999年调查中记录的9%相比大幅增加。然而，在英国出血性疾病登记处2019年的报告中，患有其他出血性疾病的患者比例为44%（ukhcdo.org）。这表明，使用“罕见”一词来概括描述这些疾病在全球范围内可能是合适的，但在发达的医疗保健系统中可能有点用词不当。事实上，这些“罕见”疾病中最常见的是XI因子缺乏症，在英国（占所有注册患者的13%）比血友病A（12%）更为普遍，比血友症B（3%）更为常见。这反映出英国犹太人的比例相对较高，还包括轻度杂合病例的登记。这些数字还表明，在全球范围内，罕见出血性疾病的诊断严重不足，特别是表型较轻的出血性疾病，这在本综述中进行了讨论。

我们无法为每位患者提供诊断，这是对疑似出血性疾病进行检查的一个众所周知的局限性。部分原因是转诊过程不完善。有时，非专家很难区分异常和正常出血模式，当由专家医师评估时，很大比例的转诊患者没有明显增加的出血倾向。然而，也有一大群明显怀疑出血性疾病的患者没有得到明确的诊断。为了确定出血倾向的增加，现代研究通常使用出血评估工具（BAT）。最近的欧洲血液学协会（EHA）共识报告使用男性≥4和女性≥6的cut-off值。在最近的队列中，许多患者的水平较低。在一个荷兰患者队列中，BAT评分中值为4.0，而在2017年维也纳出血生物库研究中，BAT评分中值为5。这并不一定意味着不存在出血性疾病的真正怀疑：年轻患者中的一个非常可疑的出血事件，没有进一步的挑战，可能是止血评估的有效指示。然而，这也可能表明转诊的门槛太低。总的来说，根据对出血症状的回顾，这是不排除的，使用先进止血测试的三级中心在30%-50%的转诊患者中最终诊断为明确的出血性疾病。

在没有诊断的情况下，不能开出针对疾病的治疗方案。对于轻度出血性疾病，这可能比预期的问题小。两个回顾性队列描述了标准方案氨甲环酸和/或去氨加压素治疗不明原因出血患者的结果。在第一组中，53例低风险手术、16例高风险手术和13例分娩，这与75/82例无出血有关。在第二个队列中，78例手术中的70例（包括小手术和大手术以及分娩）具有良好的止血效果。当然，氨甲环酸也经常用于轻度干预和特定疾病患者的月经过多轻度出血性疾病的诊断。未能确定可遗传性血小板减少症的分子原因通常会导致免疫性血小板减少的误诊，并导致不必要的免疫抑制治疗甚至脾切除术。在当代麦克马斯特血小板减少症登记册中，295名最初诊断为ITP的患者中有5名在随访期间被重新分类为遗传性血小板减少症。这证明了在诊断ITP之前获取家族病史和询问综合征特征的重要性。迄今为止，并反映了最近广泛引入的基因检测，还没有系统收集到基因诊断导致治疗计划改变的频率数据。

当无法做出具体诊断时，很难讨论预后：某些手术因出血而变得复杂的风险有多大？最近的一项研究报告称，在90名不明原因出血的患者中，出血分数越高，未来出血的风险越高。然而，样本效应的大小太小，无法在个人层面上进行有用的预测。出血风险的不确定性可导致避免手术。例如，分娩中的妇女可能无法获得神经轴镇痛。最后，明确的分子诊断使家庭成员的筛查更加准确。如果需要进行重大手术，家庭成员没有出血止血问题，这一点尤为重要。

在这篇综述中，我们将介绍一些有待证实的病例，探索实验室和基因组诊断选项，并随后讨论如何将其应用于这些病例。

2 病例情况

2.1 病例1

现年56岁的A先生在20世纪90年代被诊断为轻度血友病A。至少10年，没有使用凝血因子或去氨加压素治疗的记录。他的女儿接受了已有观念的建议，其VIII因子水平正常，没有出血症状。她进行了专门针对血友病A的基因分析，但没有发现F8基因中的任何潜在致病性变体。

2.2 病例2

B女士，18岁，从一家社区医院转诊，患有轻度血小板减少症，在拔牙后出现出血时被确诊。因为当时她还是一个蹒跚学步的孩子在进行手术后出现了立即出血，她使用口服避孕药治疗严重的月经出血和扁桃体切除术。她身体健康。除了母亲可能有轻微出血倾向外，家族史上没有什么值得注意的。血小板计数为93×109/L，MPV报告为“无法测量”，有过量的未成熟血小板。非甾体抗炎药的间歇性使用和不良记录使光透射聚集测定法感到困惑，但肾上腺素和胶原蛋白似乎会降低。

2.3 病例3

26岁的N女士因希望组建家庭而被转诊调查出血史。她的主要主诉是严重的月经过多，尽管开始口服避孕药，但仍持续存在，需要补充铁。与其他不明原因出血事件一起。她的BAT得分是9分。她的父亲有复发性鼻出血，而她的母亲和妹妹没有出血症状。此前，她的出血时间延长，凝血筛查显示PT和APTT延长。因子测定显示单独的轻度因子II缺乏，而von Willebrand因子测定的结果为临界值。

3 表型实验室分析

彻底的实验室分析以诊断患者的异常，需要对止血系统进行详细分析（图1）。由于这是血管壁、血小板、凝血和纤维蛋白溶解之间的相互作用，深入分析可能是费力、耗时和昂贵的。

图1疑似出血倾向患者的实验室评估流程图。绿色箭头表示否定结果，而红色箭头表示异常

理论上，最好的方法是对每个部分进行敏感的筛选分析。除了血管壁异常无法用实验室化验覆盖外，易于进行的筛选化验仅适用于血小板数量和凝血因子缺乏，而非vonWillebrand病。凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）是典型的凝血筛选试验。

其中一项筛查化验的阳性结果简化了对患者异常的识别，因为它指导了确认化验。如果筛选分析完全正常，但患者BAT评分升高或有出血倾向的病史，则分析会受到阻碍。在这些情况下，需要对筛选分析未充分涵盖的异常进行几次分析。这可能发生在轻度疾病，如von Willebrand疾病或血小板功能障碍，在专业实验室中使用的检测方法存在很大差异。最后，如果所有筛选和二次检测均为阴性，则进一步的检测可能包括纤溶分析（如用真球蛋白凝块溶解试验，ECLT）和止血的整体检测。甚至可以通过对静脉闭塞之前和期间获得的血浆进行分析来扩大纤溶范围。

当前实验室工作流程的一个重要限制是筛选分析仅分析一小部分止血平衡（图2）。

图 2 用于检测止血通路。

灰色框表示疑似出血倾向患者的化验结果。红色方框表示血栓形成情况下的分析。绿色文本描述了 全面 分析。 Act ， 活 性 ； Ag ， 抗原； APTT ，活化部分凝血活酶时间； BT ，出血时间； Fg 、纤维蛋白原； PFA ，血小板功能分析仪； Plt ，血小板； PT ， 凝血酶原时间； VWF ， von Willebrand 因子

凝血时间延长通常表明继发性止血异常，并且缺乏针对原发性止血缺陷的有效筛选试验。出血症状可能是由于不同止血成分的缺陷所致。此外，验证性试验通常只关注一个参数。所谓的“全局测定”，如旋转粘弹性成像、凝血酶生成、纤溶酶生成或贫血小板血浆、富血小板血浆或全血中两者的组合，可以提供更多信息，因为这些测定对止血平衡的多个部分敏感。尽管全局检测的使用越来越多，但缺乏标准化和特异性限制了诊断途径的使用。然而，如果将这些全局检测结合起来，可能有兴趣确定其益处。与当前的检测组相比，这些检测是否允许检测更多的异常，是否检测到轻微异常的组合，是否可以用于指导管理？这些是未来需要解决的重要问题。

4 新一代测序技术在罕见出血性疾病研究中的应用

了解遗传疾病的分子基础对于准确的临床诊断和疾病特异性治疗的发展至关重要。血友病治疗方法的发展很好地证明了这一点。在过去的30年中，我们见证了重组因子浓缩物的广泛使用、旁路通路的缺陷因子的分子的开发以及具有永久治愈潜力的基因治疗的引入。如果没有F8基因的发现和表征，这些治疗都是不可能的。事实上，重要的不是基因发现本身，而是它导致了在血友病临床评估中常规使用基因诊断。EAHAD数据库目前列出了10000多例血友病A病例中的3000多个独特的F8变体。正是我们从分析致病性和良性变异的影响中获得的见解，为上述突破提供了必要的分子理解深度。作为基因诊断的常规临床应用的直接结果，严重血友病A患者现在有多种新的治疗选择，可以提供正常的预期寿命，而无严重出血相关的发病率。

不幸的是，迄今为止，对血友病以外的出血性疾病进行基因诊断并不容易。这有几个原因。一些基因，如VWF，由于结构复杂性（如假基因），固有地难以分析。基于聚合酶链反应的标准测序技术在单独应用于导致罕见出血疾病的基因时成本高昂且耗时。EAHAD VWF数据库与F8相比，所列独特变体的数量约为F8的一半，尽管von Willebrand病的常见率是F8的10倍，这一事实充分证明了这一点。从本质上讲，使用一次分析一个基因的标准测序技术来支持罕见疾病的常规测序是过于昂贵和费力的。

2003年完成的人类基因组计划要求开发能够同时快速分析大量DNA序列的技术。这些技术统称为“高通量”或“下一代”测序。他们提供了获取整个基因组的途径，就人类而言，这是30亿个碱基对。成本大幅下降，现在我们可以分析整个基因组，以及其中包含的大约2万个蛋白质编码基因，其价格低于10年前一个基因分析的价格。除了这些新技术，我们还看到了生物信息学工具的发展，以处理生成的大量数据。根据明显正常个体的大型基因组数据库中列出的等位基因频率筛选变体，对其对基因结构和蛋白质功能的影响进行计算机分析，并使用算法来整理这些证据，这是确定变体是否致病所需的几层分析的一部分。然而，使用等位基因频率进行过滤可以排除一些常见的致病变异。这可以通过使用“白名单”来缓解。这些进展使得不同国家的几个项目得以重点研究罕见出血性疾病的遗传基础。有几个好处：罕见的可遗传出血性疾病患者现在可以像血友病患者一样容易地接受基因诊断，我们对罕见疾病的分子基础和表型效应的了解正在迅速增加，并且发现了许多导致出血性疾病的新基因。

如果我们以Hermansky Pudlak综合征为例，那么在NGS出现之前，只有两个基因与该疾病有联系。很少有患者能够获得基因诊断，所有患者都被认为有严重后遗症的风险，如肺纤维化和肉芽肿性结肠炎。我们现在至少有10个致病基因，只有3个与肺纤维化相关。越来越多地使用基因诊断使得肺部筛查仅限于那些需要的患者。虽然NGS使人们能够获得以前在临床环境中不可行的基因，但同时进行多基因检测的效率确实存在一些缺点。偶然的发现就是一个明显的例子。目前，可用的平台可分为提供全基因组测试的平台和提供基因小组的平台，这些面板将与特定领域相关的所有基因组合在一起。国际血栓和止血学会的基因组学科学小组委员会列出了被认为可导致血液病的基因。截至2020年2月，该列表中有101个基因，其中22个是凝血因子基因，11个是血栓形成基因，68个导致血小板异常。一个用于止血领域临床应用的基因小组预计将包含所有这些基因，随着新基因被添加到该列表中，可以进行修改。基因小组偶然发现的可能性相对较低。这一点在血栓基因组学项目中得到了证明，该项目调查了近2400名止血性疾病患者，仅产生了6项在当前指导下可报告的偶然发现。由于全基因组分析有可能获得约20000个基因，偶然发现的可能性显然要大得多。处理与感兴趣领域无关的基因中的潜在致病性变体需要不同临床学科之间的广泛互动，并且难以在当前临床服务中实施。目前尚不清楚患者是否从这些发现中获得了净收益，这引发了重要的伦理考虑。目前，临床服务主要基于基因小组，全基因组分析主要用于研究。

最后，必须了解任何诊断工具的局限性。发现潜在致病性变体的机会取决于所调查的止血障碍的类型。在血栓基因组学研究中，67%的罕见凝血因子缺乏症患者具有致病性或潜在致病性变体。对于血小板数量和/或功能可遗传疾病的患者，诊断率相当低，为38%，因为这些疾病的遗传基础没有很好的特征。通常，对特定基因变异的影响缺乏足够的知识，无法对致病性进行预测。共分离研究可能有助于大型家系中明确定义特定表型。如果这不可行，预计通过国际合作数据库积累“大数据”将有助于策展。GS仍然主要是一种测序工具，对单核苷酸变化具有极高的准确性。也可以通过读取深度的比较分析来检测拷贝数变体，但不会检测到复杂的重排。一个重要的例子是F8中的内含子22倒位，这是血友病A的最常见原因，目前的NGS技术无法检测到。我们还必须注意，伪基因和重复元素可能会导致错误的结果，非编码空间的覆盖质量不足或有许多基因。在解释负面报告时，需要考虑所有这些因素。

5 讨论

5.1 病例1（续）

目前的基因检测策略未能在约5%的非严重血友病A病例中识别出致病变异。非父子关系、嵌合体和替代诊断也可能解释预期为义务携带者的女儿中没有变异。在这种情况下，对该指数的基因检测显示了先前在两个2N型von Willebrand病家族中报道的一种变体的纯合性。随后，对他女儿的进一步基因分析表明，她是同一变体的杂合子。

5.2 病例2（续）

在Ms B中，NGS小组的应用集中于原发性止血，显示了先前报道的MYH9基因变体的杂合性。经进一步询问，家族病史为肾病、白内障或听力损失阴性。额外的检测显示患者的蛋白尿和肾功能完整，她被转诊给肾科医生。

5.3 病例3（续）

基因组小组测试揭示了VWF中被归类为致病性的无义变体的杂合性，以及F2中可能致病性变体的杂合性。在一个VWF等位基因中引入一个过早终止密码子将解释该因子的临界水平，这可能在纯合状态下导致3型疾病。同样，一个F2等位基因中的错义变体与因子II水平的轻微降低一致。孤立地说，这两种变体都不会导致显著的出血症状，但两者的结合可能会导致所描述的表型。

对于许多患者来说，本文中讨论的发展促进了诊断的改进，在某些情况下，可以获得特定的治疗或家庭成员的诊断可能性。EHA共识报告中给出了广泛调查后的全面结果列表。在我们的第一例病例中，对2N型von Willebrand病的正确诊断导致对该指数病例的治疗方案进行了修改，并对其女儿进行了适当的咨询。随着基因组检测成本的下降和获取途径的增加，有人建议可以在诊断途径中更早地使用它。与血小板聚集测定等需要患者参加新鲜血液样本的专家中心，基因组检测样本可以远程采集，甚至可以用唾液样本进行非侵入性采集，然后通过普通邮件送到检测实验室。然而，除了一些特征良好的变体，这些变体经常被报道，致病性分类是自动的，解释仍然需要与实验室分析相关，以建立基因型-表型关系。上述实验室分析不太可能很快变得多余。

遗传诊断也有缺点，尤其是在诊断具有意外临床特征的血小板疾病时。第二个案例说明了这一点，患者没有明确选择知道自己患肾病的风险增加。然而，对于MYH9疾病，诊断提供了预防措施的机会（即随访肾功能，启动血管紧张素抑制）。事实并非总是如此。

遗传性血小板疾病可根据其额外特征分为三组：“仅影响血小板”、“具有综合征表型”和“血液学恶性肿瘤风险增加”。对于第三组人来说，基因检测的后果可能是深远的。最好允许患者在知情的情况下选择测试的基因，从而控制在某种程度上，意外发现的可能性。然而，这需要在请求时对测试策略有深入的了解，并且可能不可能，这取决于NGS平台的设置方式。当考虑到亲属的权利和意愿时，这具有更广泛的道德含义。对一个谱系的多个成员进行测试可以推断出未经测试的亲属的基因型，无论他们是否同意测试。ISTH血栓形成基因组学科学小组委员会目前正在编制血小板疾病基因组检测的伦理意义指南。

总之，NGS极大地提高了我们为遗传性血小板疾病患者提供明确诊断的能力。对于先前被诊断为表型特征的其他罕见出血性疾病（即除血友病A或血友病B外的凝血缺陷）患者，先进的基因检测可提供确认、更好地了解分子病理学以及产前检测的机会。此外，NGS可以简化诊断过程，取代传统的止血检查的一部分。

Meijer K, van Heerde W, Gomez K. Haemophilia. 2022;28(Suppl. 4):119–124