浅谈三代测序技术应用

自1985年提出人类基因组计划，并取得突破性进展后，测序技术对于基因组的研究逐渐成为一种必不可少的手段。测序技术的不断更新，也为基因组研究提供了有利保障。一代测序虽然具有长读长、精确度高等优势，但由于测序通量低导致无法进行大规模测序。二代测序通量高且测序时间短，能够快速高效的进行基因组测序，但由于读长过短、PCR扩增错误、GC偏好性等缺点，虽然能拼接出基因组，但很难拼接到染色体水平。而三代测序的出现，基于单分子测序技术，且无需PCR扩增，避免了PCR扩增引入的错误，因此对于基因组测序而言，同时具有了高通量、高效率、长读长的优势，可以使越来越多的物种组装出高质量的基因组。

目前市面上常用的三代测序为Pacific Bioscience的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术，这些技术的出现，大大提升了基因组组装的效率。而除了基因组组装之外，利用其技术优势，在很多方面都得到了有效利用。下面就为大家介绍基于这两种测序平台的主要应用方向。

大基因组组装

在今年4月份《Science》期刊发表的全球第一个完整的、无间隙的人类基因组序列，首次揭示了高度相同的节段重复基因组区域及其在人类基因组中的变异，研究中同时采用了Nanopore及PacBio测序。在基因组组装方面，三代测序具有其无可代替的优势，长读长、重复序列、GC含量异常等，通过三代测序都可以得到很好的解决。

全长转录组测序

与常规的二代测序相比，基于三代的全长转录组测序可以完整地检测出全长的转录本序列，从而捕获每个转录本的转录起始位点、剪接位点和多聚腺苷酸化位点。此外，利用全长转录组测序获得mRNA的全长序列可以极大地简化基因组注释工作，并有利于新RNA异构体的发现。

利用全长转录组测序可以应用在以下几个方面：

微生物测序

三代测序在微生物领域主要有三方面应用，通过基因组组装获得细菌完成图或真菌精细图；利用全长16S技术快速鉴定微生物物种；在不同的微生物群落中通过宏基因组binning分析获得单一菌株基因组。

1. 微生物基因组组装

为了深入探究某一功能菌种的遗传学特征及生物学功能，需掌握该菌种的基因组信息，这时候通过二代或三代测序就可将测序得到的DNA片段进行组装，获得基因组序列，并基于该序列，可以对菌株中的基因进行预测和功能注释，还可与已知物种进行比较，获得二者基因组之间的差异，为发现基因-表型的联系及研究其致病或有益机制提供有力的依据。

2. 全长16S测序

16S测序是通过扩增细菌的可变区，研究群落的物种组成，物种间的进化关系及群落的多样性不同。基于二代测序的16S一般仅扩增可变区的一部分，如V3、V4区，而全长16S测序则是扩增全长的可变区域，可以更好的鉴定到物种的种水平，甚至菌株水平。

3. 宏基因组Binning

宏基因组分箱(binning)是指对宏基因组测序结果中不同微生物的reads或contigs进行聚类，最终得到单一菌株基因组的过程。相比于常规的宏基因组分析，binning的优势在于单菌水平的基因和功能注释分析以及挖掘新的微生物等方面。

基因治疗

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体作为基因治疗中的明星载体，具有安全性高、免疫原性低、不致病等优点，具有广阔的前景。然而，AAV载体本身的制备和基因治疗产品的固有特性也为其带来了安全性风险，促使监管部门采取了严格的监管措施。

除了常规的质检方法，如qPCR对载体进行滴度检测和定量、琼脂糖凝胶电泳验证基因组大小、银染聚丙烯酰胺凝胶电泳表征病毒纯度等，还可以利用测序技术检测AAV基因组的组成和结构以及所占比例。由于AAV的反向末端重复序列（ITR）能形成高度稳定的二级结构且GC含量高，因此利用二代测序常用来分析病毒纯度和序列变异度。三代测序利用其优势，可以跨越AAV载体的单个完整分子对其进行检测，完整表征AAV载体的异质性。

AAV基因组的覆盖深度（两侧不同颜色区域标记出ITR）

根据测序技术的不同原理及特点，可以分别采用Sanger测序检测AAV质粒中ITR序列信息、二代测序分析病毒纯度和序列变异度、三代测序评估AAV-ITR及AAV载体完整性。

mRNA疫苗研究

mRNA疫苗相比于传统疫苗具有免疫原性强、安全性高且易研发与生产等优点。伴随着体外mRNA的合成、加工、递送等技术不断地成熟，mRNA疫苗药物商业化生产的步伐在不断加快。而对mRNA疫苗的生产工艺、质量特性、质量标准等检测也提出了明确要求。为了尽可能同时检测多个mRNA质量相关指标，可以利用三代测序技术进行检测，同时获取mRNA序列长度、序列准确性及完整性、PolyA尾长度等结果，对mRNA的序列特征、纯度、产品相关杂质等质量特性进行准确质控。

技术优势

以上就是小编为大家介绍的三代技术的一些应用，当然三代测序的应用也不仅限于此。随着技术的不断更新，我们相信利用三代技术会为大家带来更多更广泛的应用！