第二代测序原理的详细解析！

第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。我们都知道一代测序为合成终止测序，而二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长（不超过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短的特点。二代测序适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区），而基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法（Shotgun method）打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。

文库构建

文库构建即为测序片段添加接头。无论是PCR产生的片段还是基因组鸟枪法打断的片段都具有特异性（PCR中不同样品反向引物插入了特异性的barcode，因此两端也是特异的），两端缺乏必要的引物因此混合DNA片段不能直接扩增和测序。DNA片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建。下面我们以常用的试剂盒NEBNext®Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®为例阐述二代测序文库构建的流程及其原理，具体如下所示：

①末端修饰。目前很多PCR使用的高保真Pfu聚合酶产生的片段末端是平齐的（也即没有不配对的碱基）；鸟枪法产生的片段则是随机断裂，其末端可能是平齐的也可能是不平的。因此，建库第一步是使用Taq聚合酶补齐不平的末端，并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Taq酶扩增，则无需末端修饰），产生粘性末端的片段可以添加接头（Adaptor）。

②添加接头。经过末端修饰后的PCR片段末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端。NEB的接头为特殊的碱基U连接的环状结构（可以增强稳定性），因此连接接头后，还需要将碱基U删除从而形成“Y”形接头。这一步添加的接头主要是为了后续PCR中作为引物扩增继续添加文库index和与测序平台互补的寡核苷酸序列（此外还作为测序引物Rd1 SP/Rd2 SP），而之所以为“Y”型开叉结构，是因为每一端接头是两条不互补的序列（每一端都是Rd1 SP与Rd2 SP交错），因为连接酶没有选择性，每个接头都是只靠突出的T来与DNA连接，“Y”接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物，从而在后续PCR中可以连接不同的寡核苷酸序列（P5/P7），具体流程见下图。

③磁珠纯化。添加接头后的文库体系中含有聚合酶、连接酶等各种酶以及辅助物质，接头的添加也是过量的，而且由于末端的不稳定性，容易形成自连片段，鸟枪法打断的片段中也可能有大片段存在，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）纯化来去除大片段以及各种杂质，从而获得成功添加接头的文库片段。其原理为磁珠可以通过氢键等作用力来吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小选择的能力，但其储存的buffer里面含有20%的PEG 8000，PEG浓度越大则可以吸附的DNA片段越小。因此磁珠纯化的时候要根据文库片段不同严格控制磁珠添加量（其实是PEG添加量）来实现片段选择。

④PCR扩增。添加了接头的DNA片段，可以使用与接头互补的引物来扩增。这个过程非常重要，因为目前所有片段其两端是不互补的Y形结构，不能直接进行测序；此外，片段还需要添加用于区分不同文库的特异性index，以及与测序仪芯片互补的两种寡核苷酸序列（P5/P7）。

⑤第二次磁珠纯化。PCR后需要将产物DNA片段与聚合酶等杂质分离，因此再次进行磁珠纯化，之后进行质量检测，包括DNA浓度检测、琼脂糖凝胶电泳和片段长度检测，完成建库。

测序是以单链为单位的，建库完成后的每条DNA的单链均一端连有测序引物Read1 Sequencing Primer（Rd1SP）和P5，另一端为Rd2 SP、Index（Barcode）和P7。Index用来区分不同的文库，因为测序仪一个run产生数据量巨大，由于实际情况不同，一次上机常会进行多个文库测序，因此需要加上Index来区分。

上机测序

Illumina测序技术为基于基因芯片的边合成边测序，整个平台可解剖为三个系统：一温度控制系统，原理和普通PCR仪一样，来控制反应的进行；二酶控制系统，通过各种酶来控制DNA合成与剪切；三荧光信号收集系统，可以理解为分辨率极高的照相机。在Illumina测序平台的流通池（Flow cell）表面，通过基因芯片技术交错固定了无数条分别文库接头中P5和P7互补的寡核苷酸链（即短核苷酸链），单链化的文库DNA片段进入流通池后，可以与表面的寡核苷酸结合，从而进入测序过程。测序具体流程如下：

①首先以寡核苷酸为引物、文库片段为模板进行DNA复制（因为文库稀释后浓度足够低，可以认为文库片段均匀的结合在流通池表面，每个片段结合的位置相距足够远，这很重要，否则测序时会导致信号叠加而不能识别）。复制完成后解链，将文库片段洗去，留在流通池表面的为与文库模板互补的DNA链。

Flow cell图样

②因为单链DNA另一端为不同的接头序列，可以与相邻的另一种寡核苷酸互补结合，之后进行“桥”式扩增（假如第一次结合的为P7，则复制完成洗脱模板后顶端可以与相邻的P5互补结合形成“桥”，并以P5为引物进行复制，完成后再次解链并与相邻不同种接头结合来进行复制，如此类推）。25-28个循环完成后，原来散布在表面的单核苷酸序列变成散布的DNA簇，这一步主要是为后续测序做准备，因为测序时单分子产生的光信号很弱，难以检测。

芯片结合与桥式扩增

③“桥”式扩增后一个DNA簇都是由最初的一个文库模板复制而来，但是这时候P7上的序列与P5上的序列是分别从两端开始的，测序要保证每个片段一致性（都是正向或都是反向），因此再次解链线性化，切割并洗去P5上的DNA链，只留P7上的DNA单链。Illumina巧妙地利用了甲酰胺基嘧啶糖苷酶Fpg对8-氧鸟嘌呤糖苷8-oxo-G的选择性切断作用，在合成的引物链上加入了一个8-oxo-G，用Fpg处理，就把带8-oxo-G基团切掉，并把DNA链切断，留下一带不完整糖基的磷酸基。这个磷酸基在接下来的过程中，起到了阻止P5延伸的作用。此后的双末端测序中需要恢复3'-OH，则用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶AP-endonuclease把带不完整糖基的那个磷酸基切掉。

④加入测序引物Read1 SP和修饰过的DNA聚合酶，则在测序引物3’端开始DNA复制。在流通池加入可逆终止荧光dNTP，其3'-OH被阻隔（糖基3'连接有叠氮基团，在链延伸时起到了阻止添加下一个dNTP作用，因此在除去阻隔前只能添加一个碱基），4种dNTP在碱基上分别连接有不同颜色的荧光基团（也可以相同颜色荧光标记，但是测序会更慢，每次只能添加一种碱基）。之后洗掉多余的dNTP，使用激光扫描，收集留在流通池表面的荧光信号（如图1-6所示）。用巯基试剂去掉3’位阻断的叠氮基团，用TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,三(2-羧乙基)膦)去掉荧光基团，进入下一个碱基的测序反应。因为每条DNA单链扩增形成的DNA簇均固定在表面，随着反应进行根据相同位置出现的荧光信号情况，就逐渐读出了改位点DNA链的序列。

边合成边读取流程

⑤要保证测序的准确性，需要一个位点DNA簇的每条链同步复制，然而随着反应进行，不同链复制情况会出现差异，因此二代测序读长目前限制在300bp以内。Read1结束后，解链并洗掉测序中已经合成的部分，加入测序引物Index引物（也即Read2 SP互补的寡核苷酸），这时会继续在3’端进行复制，读出接头中Index序列，从而可以确定出每个位点的DNA属于哪个文库。

⑥为了增长测序长度，进行另一个方向测序，也即双末端测序。洗掉前面复制合成的片段，DNA单链继续在流通池表面形成桥式连接，这时要用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶处理修复P5的3’-OH末端，加入聚合酶，则在P5末端开始DNA复制。十几个循环后，将P7上的DNA切割并洗掉。Illumina通过在P7核酸链中加入一个U碱基，用USER酶（Uracil Specific Excision Reagent，尿嘧啶链特定切断试剂）来切隔断链。这时只留下P5上的DNA链，与Read中方向相反。加入测序引物Read2 SP，进行另一端的序列读取。

测序数据

一般我们接触到的测序数据为fastq格式的碱基序列，然而早期Illumina平台直接下机数据为bcl格式文件，其储存的是显微拍摄得到的荧光信号信息，如下所示（此图为不同碱基使用相同荧光标记的扫描结果）：

将相同区域不同时间拍摄的荧光图片按照时间顺序叠加处理，就可以获得该位点结合的DNA序列的碱基顺序。

参考文献

[1] ClarkeA C, Prost S, Stanton J a L, et al. From cheek swabs to consensus sequences: anA to Z protocol for high-throughput DNA sequencing of complete humanmitochondrial genomes[J]. Bmc Genomics, 2014, 15(1): 1-12.

[2] BowmanS K, Simon M D, Deaton A M, et al. Multiplexed Illumina sequencing librariesfrom picogram quantities of DNA[J]. Bmc Genomics, 2013, 14(1): 135-143.

[3] MardisE R. Next-Generation DNA Sequencing Methods[J]. Annual Review of Genomics &Human Genetics, 2008, 9(9): 387-402