湖南大学袁林课题组Angew.：高特异性成像癌细胞的罗丹明染料的分子设计

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区分癌细胞/组织和正常细胞/组织对于癌症的诊断和治疗至关重要。近些年来，为了能够实现这个目标，科学家们已经开发了多种技术，如X-射线计算机层析成像（CT）、超声（US）、正电子发射计算机断层扫描（PET）、磁共振成像和荧光成像等。其中，凭借低成本、无辐射、高分辨率和实时成像的优势，基于荧光探针的成像技术已经引起了科研工作者的广泛关注。利用癌细胞中生物标志物（GSH、ROS、酶等）的过表达或微环境（pH、粘度、极性等）的异常，众多可以识别癌细胞的荧光探针已经被开发，但由于癌细胞和正常细胞中生物标志物含量和微环境差异较小，这些探针往往在两种细胞间表现出较低的成像对比度。另外，由于细胞内外存在浓度差，在癌细胞中探针激活释放的染料倾向于从癌细胞扩散至介质或临近组织，这在大幅度降低癌细胞内成像信号的强度和持续时间的同时，也降低了癌细胞/组织的成像对比度。因此，开发能够高对比成像癌细胞的荧光探针成为了领域内的研究热点和难点。近日，湖南大学袁林教授课题组系统调控了不对称罗丹明染料的细胞摄取能力，并实现了癌细胞/肿瘤的特异性成像，相关研究成果发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202218613）。

图1. 高特异性区分癌细胞的荧光探针

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

袁林教授课题组近年来长期致力于新型有机功能染料的设计及生物医学应用研究。此前，该团队通过将十氢喹喔啉引入对称染料，构建了一系列具有大Stokes位移的不对称荧光染料DQFs（J. Am. Chem. Soc.2018, 140, 7716-7722）。之后，针对现有改性方法难以同时提升多种染料性质的问题，该团队又提出了将抑制TICT作用与不对称染料体系相结合的分子设计策略，成功构建了一类兼具高亮度、高光稳定性和大Stokes位移的荧光染料YLs，并将其中的旗舰染料YL578用于超分辨成像研究（3D STED成像和多色STED成像）（Nat. Commun.2022, 13, 2264）。

在此工作的研究基础上，该团队使用极性的氨基烷基取代YL578染料中的三氟乙基，在保持较高荧光亮度、降低染料细胞摄取的同时，赋予了染料区分癌细胞和正常细胞的能力（5.6 倍），而酰基化屏蔽极性氨基能够降低染料的亮度，提升癌细胞对染料的细胞摄取，进而增大癌细胞和正常细胞间的信号比（16.4倍）。并且利用酰基化带来的亮度差，通过构建激活型荧光探针，他们进一步提升了信号比（56倍）。由于较差的透膜能力，探针激活后释放的染料能够滞留在癌细胞中，可以长时间成像癌细胞。最后，他们将该策略拓展是其他类型的不对称罗丹明染料，证明了这种调控染料细胞摄取的策略在构建用于特异性区分癌细胞的不对称罗丹明荧光染料/探针中的普适性。

图2. NYL染料的合成及光谱性质

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

由于较高的pKa，极性氨基在中性的缓冲溶剂中很容易发生质子化，转变为强吸电子的铵基，从而赋予染料较高的荧光亮度。使用乙酰基屏蔽氨基会抑制氨基质子化，降低染料荧光对pH的敏感性。并且，延长烷基链长度和将氨基替换为难质子化的羟基都会导致染料的亮度降低，这都说明了氨基质子化是导致染料保持较高亮度根本原因。

图3. 评估NYL衍生物在癌细胞和正常细胞中的细胞摄取效率

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

通过对比固定细胞和活细胞中染料的亮度，作者发现染料NYL2被细胞摄取的情况较差，而乙酰化和酯化能够显著提升染料的细胞摄取效果。值得关注的是，乙酰化能特异性增加染料被癌细胞摄取效果，导致癌细胞和正常细胞间具有较大的荧光信号差异（16.4倍）。随后，通过温度及抑制剂实验，作者发现NYL染料不同于母体染料（RhB和YL578），它们以主动运输的方式进入细胞，并且可能涉及到酸介导和小窝蛋白介导的细胞内吞作用。因此，NYL染料特殊的细胞摄取能力可能与运输方式的改变、癌细胞对荧光染料具有更强的细胞摄取相关。

图4. 基于染料NYL2构建的激活型荧光探针

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

利用乙酰化造成的亮度降低，作者构建了一系列的荧光探针，这些探针在检测癌细胞中过表达的生物标志物时具有灵敏度高、响应速度快和选择性好等优点。

图5. 探究探针NYL2-NQO1的细胞成像性能

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

相较于参比探针（RhO110-NQO1和HD-Cl-NQO1），NYL2-NQO1能够高效区分癌细胞和正常细胞，可以用于区分混养细胞中的癌细胞。并且，激活后释放的染料能够滞留于癌细胞中，可以实现癌细胞的长时间成像。

图6. NYL2-NQO1在活体成像中的应用

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

NYL2-NQO1同样能够对活体肿瘤的边界进行清晰可视化，并且在被激活后，能够滞留在肿瘤中，实现对肿瘤的长时间成像。

最后，作者将该策略拓展是其他类型的不对称罗丹明染料，证明了该策略具有一定的普适性。该工作为构建用于高特异性成像癌细胞/肿瘤的荧光染料/探针提供了新的设计思路。

该工作的通讯作者为湖南大学袁林教授。湖南大学博士研究生蒋钢威为论文第一作者，湖南大学任天兵副教授、博士研究生娄霄峰和左姗、硕士研究生刘茜璇也参与了本课题的研究。该项目的完成得到了湖南大学张晓兵教授和复旦大学王璐研究员的支持、国家自然科学基金和湖南省科技计划基金的支持。

袁林教授简介

袁林教授系湖南大学化学化工学院、化学生物传感与计量学国家重点实验室教授，博士生导师，获得国家自然科学基金优秀青年科学基金、“万人计划”青年拔尖人才和湖南省科技创新领军人才等项目的支持。长期从事荧光染料和探针及在传感与成像分析应用等相关领域的研究，2012年至今，以通讯或第一作者论文在J. Am. Chem. Soc.（10篇）、Angew. Chem. Int. Ed.（10篇）和Nat. Commun.（1篇）等期刊发表高水平论文70余篇，总引用12000余次，h指数为58，连续入选2020和2021“中国高被引学者”榜单。课题组发展的染料被国内外多个课题组应用于成像与诊疗试剂的构建，并且部分探针已被其它课题组用于生物学研究。

课题组主页：http://grjl.hnu.edu.cn/p/F7742B53D97CE182758967E578323672

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