20 个蛋白 WB 转膜的条件摸索经验分享

原标题：20 个蛋白 WB 转膜的条件摸索经验分享

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WB 经常出现实验结果不如意的情况，除了抗体原因，转膜恐怕是 western blot 成败的最关键因素。本文总结了 20 个分子量蛋白转膜的时间，希望对大家有用。

包括蛋白来源、蛋白名称（或类型）、蛋白分子量、WB 用膜类型、孔径、转膜方式（恒压、恒流）、转膜时间。

「进阶」

WB 实验结果问题

WB 堪称基础分子实验中的「玄学」，其中常见问题和注意事项真的太多，一不小心就会翻车。以下常见问题可供排查。

Q： 没有阳性条带怎么办？

A：可能是以下几个原因

抗体染色不充分，建议增加抗体浓度，延长孵育时间。

酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，需要设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

试剂不匹配，一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。需要通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。

抗体染色不充分，建议增加抗体浓度，延长孵育时间。

酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，需要设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

试剂不匹配，一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。需要通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。

Q：有阳性条带，但条带比较弱怎么办？

A：可能是以下几个原因

抗体染色不充分，建议增加抗体浓度，延长孵育时间。

酶活性降低，需要直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

标本中靶蛋白含量太低，增加标本上样量。

洗膜过度，建议缩短洗涤时间。

HRP 抑制剂，所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

抗体活性降低，选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。

封闭过度，减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。

曝光时间过短，延长曝光时间。

抗体染色不充分，建议增加抗体浓度，延长孵育时间。

酶活性降低，需要直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

标本中靶蛋白含量太低，增加标本上样量。

洗膜过度，建议缩短洗涤时间。

HRP 抑制剂，所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

抗体活性降低，选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。

封闭过度，减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。

曝光时间过短，延长曝光时间。

除了转膜，跑胶、抗体孵育，过程中还会遇到更多实验相关问题，丁香实验汇总了 WB 经验汇总：

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