wb实验目的、原理和步骤

 在做WB实验时总会遇上这样那样的问题，比如WB检测信号弱、检测不到条带、背景深等，其实严格按要求做，控制好实验中的几个关键步骤，分分钟搞定WB~

    蛋白样品的制备与定量，好的蛋白是成功的一半

    1.提细胞蛋白

   （1）消化或刮下细胞至1.5的EP管中，标记，10000r离心2min，PBS洗3遍

   （2）吸去EP管中PBS，最好用滤纸吸干里面的水分，加适量RIPA裂解液（RIPA裂解液：蛋白酶抑制剂=250:1），如果你想做信号通路指标还得再加上磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂：RIPA裂解液=1:1000）

   （3）冰上裂解30min~1h，开4°离心机

   （4）4°离心11000r，20min

   （5）测蛋白浓度，取上清，加蛋白上清的四分之一体积5x上样loading buffer，煮沸，分装（蛋白质变性）

    2.提组织蛋白

   （1）研钵中倒入液氮，加入组织块，研磨，加液氮，药匙刮

   （2）刮下后放入1.5ml的EP管，加适量裂解液，吹打

   （3）冰上放置1h，期间，每隔10~15min吹打一次，开4°离心机

   （4）4°离心10000r，1h

   （5）测蛋白浓度，取上清，加1/4体积5x loading buffer，煮沸，分装

    3.测蛋白浓度（BCA法）

   （1）八个标准孔，按说明书先加超纯水，再加标准蛋白液

   （2）目的孔，每孔加18ul超纯水+2ul目的蛋白

   （3）按说明书配BCA工作液，每孔加200ul

   （4）37°放置半小时后测浓度

    4.计算上样量，设计上样顺序

    上样体积：上样量/浓度x 5/4

    上样顺序：无处理，对照，处理；体积最好不要相差太大

    经验总结：

如何提高蛋白浓度：首先当然是多种点细胞啦，其次可以少加点裂解液，尽量裂解充分。

如何处理蛋白浓度低的问题：实验过程中发现蛋白的浓度太低，如果上样的话，体积太大，甚至电泳孔都装不下，举例：假设我需要上样40ul才能达到20ug，那么显然按照常规的方法，10孔的梳子只能加25ul左右，我们此时可以取40ul蛋白入EP管中，放置于PCR仪器，变性温度浓缩蛋白体积，这样不断浓缩之后促使EP管中蛋白的水分降低，蛋白量依旧是20ug。

如何保证对照组和实验组蛋白浓度大概是一致的：种植细胞的时候尽量保持铺下去的细胞数接近，收细胞之后观察细胞的多少适当加入几倍体积的裂解液。

    电泳

   （1）清洗玻璃板，去离子水冲，风干或烤干（一定要以处女座的精神去严格要求自己把板子洗干净，相当重要）

   （2） 按说明书配胶。先配下胶（分离胶），一般两块板配10ml的10%的胶（20~80kDa通用）胶的浓度根据你所需要跑的蛋白的分子量大小决定,混匀后灌胶，立即用正丁醇或无水乙醇封，待凝固后倒出正丁醇，用去离子水冲洗，滤纸吸干

   （3）配上胶（积层胶），参考说明书，一般两块板配4ml的5%的胶，混匀后灌胶，插板,待凝固。（可4°过夜）

   （4）配电泳液（tris3.03g，甘氨酸14.4g，SDS1g，定容至1L）

   （5）将玻璃板装好放入电泳槽中，加电泳液，轻轻拔梳。

   （6）上样（这是每个WB达人最能装逼的一个环节，高手会告诉你凭感觉加样连孔都不用看）

   （7）连接电源，一定要注意红对红，黑对黑，定电压和时间，上胶（90v，约40min，maker分出条带），换压，下胶（120v，2h）。（不要让溴酚蓝跑出去）

    经验总结：

想要条带跑的好看点，最好把上胶稍微配高一点。

换电压主要是看溴酚蓝有没有跑到下胶，没有确定的时间点

胶最好现配现用，如果需要保存最好用湿润的保鲜膜包好

    转膜

    整个WB过程中最重要的环节

   （1）跑到溴酚蓝距离最下缘25px时配电转液（tris3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇100ml，定容至1L）

   （2）在电转液中剥胶，裁胶，剪膜，膜活化（甲醇1min，去离子水1min，电解液15min）

   （3）“三明治”黑板~海绵~三层滤纸~胶~膜（正面朝下，分清左右，与胶对应）~3层滤纸~海绵~白板，夹紧后放入电转槽中。（海绵，滤纸，膜需浸润透，过程中不能干，赶赶气泡）

   （4）连接电源，一定要注意红对红，黑对黑，定电流和时间（150mA，1h，若分子量大于90，再加200mA，2h）具体情况具体分析

    经验总结：

溴酚蓝跑到最终的距离是根据你所需要切的分子量决定的，假如你就只需要切一条ACTIN(43Kda)这样的，你完全只需要跑到下胶，看到差不多marker分开了就可以切胶了。假如你要从最上到最下切好多条出来，你则需要把溴酚蓝尽量跑到最下面，这样marker容易被跑开，有利于切胶。

滤纸和PVDF膜的裁剪必须要整齐，干净，标记清晰。

PVDF膜型号的选择要正确。如正常的30~170kDa的分子一般需要孔径0.45mm的膜就足够了。太小的则需要选择孔径为0.22mm的膜。

关于转膜是否要加SDS的问题。SDS带负电，加SDS一般是针对那些分子量大的WB，加入SDS可以增加分子导电性，这样更利于转膜。

关于转膜电流，分子是否能够转过去和转膜时间没有必要关系，而更在于转膜电流的大小。举个例子，200kDa的分子量，你用90mAh就算转一年都转不过去。

    免疫印迹

   （1）膜处理（甲醇1min，风干（放滤纸上），甲醇1min，水1min）

   （2）封闭（用TBST配5%牛奶）1h配摇床

   （3）加一抗，牛奶稀释,所需浓度参考抗体说明书，看膜的大小配多少一抗，4°过夜。

   （4）室温孵育20min

   （5）0.1%TBST洗10min x 3次配摇床（0.1%TBST：tris12.1g，NaCl87.66g，HCl至PH7.6后定容至1L后，加入1ml的TWEEN20）

   （6）加二抗，牛奶稀释，一般1:10000，1h配摇床

   （7）0.1%TBST洗10min x 3次配摇床

   （8）发光（A液B液等体积混合，孵膜1min，正面朝上放入仪器内发光）

    经验总结：

封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而且封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA的效果会比5%牛奶要好。

信号通路一般都是用5%BSA封闭。

信号通路在洗膜的时候用快速摇床5min/次 3次就可以了。

如果你想省时间，一抗可以放在37℃1~2hour，但是一定要封好，以免温度太高而导致抗体干了出现假阳性。二抗可以37℃半个小时。

发光液的选取，如果是一般的抗体，建议用一般的发光液效果会好一点，如keygen的，背景会比较干净。但是一些难发出来的一般建议用灵敏度更高的发光液如FD的或者是MILLIPORE之类的发光液。

    结果分析

    解析：由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶

    处理办法：配胶时一定要充分混匀，待其充分凝固后再做后续试验

    解析：样品不溶性颗粒

    处理办法：加样前最好是离心一下样品

    （这是个内参β-actin）

    解析：蛋白样品没有浓缩，量太大

    解析：转膜的时候没有把三明治里的气泡干掉