实验一直没有结果，看看是不是抗体用错了

实验⼀直没有结果，看看是不是抗体⽤错了

——WB

，

IP

，

IHC

，

IF

，

ChIP

，

FC

所⽤的抗。。。

⽣物医学科研⼯作者的科研基本离不开抗体，

WB

（

western

blot

）

,IP(immunoprecipitation), IHC(immunohistochemical 

免疫组

化

),IF(immunofluorescence 

免疫荧光

),ChIP(Chromatin

immunoprecipitation)

，

FC(flowcytometry 

流式细胞

) 

都需要⽤到抗体，那么这⼏种实

验⽅法中的抗体有什么区别呢？

我们在

CST

官⽹上⾯找

p53

的抗体，得到了如下的页⾯

可以看出

p53

抗体有很多种，并且每种抗体能做的实验还都不⼀样，那么为什么不同的抗体能做

的实验不⼀样呢？这要从抗体是如何制备的开始。

1. 

如何才能成为⼀个优秀的抗原？

制备抗体之前最重要的是如何制备抗原。⼀个良好即优秀的抗原应该具备的素质是

a. 

分⼦⾜够⼤。

我们知道抗原与抗原之间的区别是由抗原决定族决定的，抗原决定族⼜叫做表

位（

epitope

），这些表位通常是由

6-8

个氨基酸组成的。⽽且要

5-10kD

才有⼀个表位，所以⼀

些分⼦量太⼩的蛋⽩质或者多肽很难有⼀个表位的，也很难作为⼀个合格优秀的抗原。注意表

位有两种形式，⼀种是线性表位，即由氨基酸的序列决定的。另外⼀种是构象表位，是由氨基

酸的空间结构决定的。两个相隔很远的氨基酸序列在空间结构上靠在⼀起可以形成⼀个结构表

位。

b. 

外源性强。我们常常将抗原注射到动物内体得到抗体，因此抗原必须要与该动物体内的成分

区别性⼤，因为动物对⾃⾝的物质形成了免疫耐受，如果抗原与动物⾃⾝的物质⾮常相似，则

很难引起强烈的免疫应答，也很难得到好的抗体。

c. 

结构尽量复杂。有些物质即使分⼦量很⼤也不能算是⼀个合格的抗原，⽐如明胶分⼦量特别

⼤，也属于外源性强的物质。但是明胶的氨基酸基本上是直链的氨基酸，在体内容易被降解，

类似的淀粉、核酸、多聚赖氨酸也是⼀样，不是⼀个合格的抗原。

2. 

制备抗体中常⽤获得抗原的⽅式有哪些？

a. 

⼈⼯合成多肽。很多家族蛋⽩相似度很⾼，⽐如

actin

家族中

 a-actin, b-actin, r-actin

三者之间

⾮常相似，基本上只差⼏个氨基酸，⽽这些差别的氨基酸往往还被包裹在内部。因此只有⼈⼯

合成这些差别的序列多肽，才可能区分开这三种相似的蛋⽩质。制备出来的抗体⼤部分是识别

线性结构的蛋⽩质。

b. 

纯化的重组蛋⽩。重组蛋⽩⽐较容易获得，⽽且能够获得⽐较⾼的纯度。但是在重组蛋⽩中

我们为了纯化往往要加⼊⼀段标签（⽐如

GST

，

 His, Flag

等），拿这些带有标签的重组蛋⽩去

免疫动物，⾃然也会得到对标签识别的抗体。我们常常⽤

His

作为标签，因为它⽐较⼩，⽽且免

疫原性⽐较弱，产⽣的抗体可以忽略。制备的抗体可以识别线性结构的蛋⽩质，也可以识别天

然折叠状态下的蛋⽩质。

c. 

纯化的天然蛋⽩。天然蛋⽩存在修饰，结构复杂，因此是⽤来做抗体最好的抗原。但是很遗

憾天然蛋⽩很难达到较⾼的纯度。制备出来的抗体最优是识别天然状态下的蛋⽩质，对线性结

构的也能识别。

3. WB

，

IP

，

IHC

，

IF

，

ChIP

，

FC

之间对抗体需求有什么区别？

在理解上⾯技术对抗体需求的区别之前我们⾸先要知道这些实验技术都需要什么样的抗体。

a. WB. WB

的蛋⽩经过加热变性之后都变成线性的结构。因此最好的抗体是采⽤⾮常特异序列的

⼈⼯合成多肽的⽅法来做实验，结果也⾮常特异。

b. IP/CHIP. 

我们⽤抗体去结合⽣理状态下的蛋⽩质，因此

IP

的抗体最好使⽤纯化的天然蛋⽩制