D2B加速PROTAC的合成和评估连接子对渗透性和降解性的影响

　　靶向嵌合体的蛋白水解(PROTACs)是一种新兴的治疗方式，具有调节蛋白靶点的潜力。PROTAC通过同时招募靶蛋白和E3泛素连接酶，从而形成靶蛋白-PROTAC-E3泛素连接酶的三元复合物，使靶蛋白被E3连接酶泛素化。被泛素化的蛋白可以被细胞内的蛋白酶体特异性识别并降解，与此同时PROTAC被释放重新参与循环[1−8](图二)。PROTACs由一个E3连接酶的配体，如cereblon(CRBN)和von Hippel Lindau(VHL)，以及一个共价连接子连接的目标蛋白(POI)配体组成。目前已有多个PROTACs进入临床阶段，并引发了大家高度关注[9−12]。

　　Scott课题组基于连接子效应的D2B(direct-to-biology)，成功开发了一个加速蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)优化的平台。该平台通过简化合成步骤可以制备表征不同长度、极性和刚性的连接子类似物。Scott组进行了深入的验证研究，并证实了D2B平台是一个有价值的加速PROTAC设计−制备−测试的工具。

　　PROTACs的优化仍然存在许多挑战。Protacs由于低细胞渗透性，透膜能力差、口服生物利用度和中枢神经系统暴露的原因而偏离Ro5规则。二元复合物的构效关系SAR仅考量了配体与目标蛋白或E3连接酶之间的关系，忽略了三元配合物的协同效应。形成的三元配合物通常在细胞降解中分析评估，但细胞的渗透性效应可能会影响三元配合物的构效关系SAR。尽管在构象研究中已经对降解的三元配合物进行表征，但溶液中存在的多种潜在混合物，使得降解的三元配合物通过结构导向优化几乎不大可能。

　　为了加速PROTAC优化，Scott课题组开发了一个结合高通量化学和高通量细胞分析法的平台。该平台增加了PROTAC优化周期中的数据，并为预测建模提供了数据支持。此平台中也应用到了D2B方法[13−16]，通过小量反应(图三

PROTAC连接子在降解、三元配合物形成、ADME属性中发挥重要作用；因此，课题组设计了D2B PROTAC连接子实验。第一代PROTACs，如dBET1 (1)，使用柔性连接子，近期发表的Protacs如ARV-110和JNJ-1013，则使用的是刚性连接子（图三）。利用dBET1（图三）为模型系统，设计D2B合成库，研究降解剂的连接子SAR。

连接子选择（图四）是从商业和自有产品中得到5000多个N-Boc二胺，并依据FCFP4 fifingerprints ，H-bond donor/acceptor count, molecular weight, topological diameter, rotatable bonds筛选得到了近2800个连接子（图四）。从虚拟库中，选择了91个PROTACs进行合成，展示了属性空间（图四）和化学空间（图四）的分布并由SOM表示。验证有效的连接子，课题组从91个连接子中制备了两个PROTAC D2B库：JQ1-可变连接子-tDHU和JQ1-可变连接子-O-Pom，并进行了验证表征（图五）。

展示的D2B和纯化样品的剂量−响应曲线（图六）对于从D2B库中优先选择PROTACs具有指导意义。

D2B合成对PROTACs的评估提供了一个可以加速E3连接酶靶结合、蛋白降解效力、渗透性和细胞毒性中连接子的SAR平台。利用二胺分子砌块的合成多样性，分析了大量降解物。高通量的D2B方法研究了大量连接子以及连接子结构与E3连接酶配体之间的关系。最后，D2B提供了加速经验优化的方法，同时也通过大量数据创建了预测建模。

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参考文献：

(1) Chamberlain, P. P.; Hamann, L. G. Development of targeted protein degradation therapeutics. Nat. Chem. Biol. 2019, 15, 937−944.

(2) Hu, Z.; Crews, C. M. Recent Developments in PROTAC Mediated Protein Degradation: From Bench to Clinic. ChemBioChem 2022, 23, No. e202100270.

(3) Faust, T. B.; Donovan, K. A.; Yue, H.; Chamberlain, P. P.; Fischer, E. S. Small-Molecule Approaches to Targeted Protein Degradation. Annu. Rev. Can. Bio. 2021, 5, 181−201.

(4) Burslem, G. M.; Crews, C. M. Small-Molecule Modulation of Protein Homeostasis. Chem. Rev. 2017, 117, 11269−11301.

(5) Dale, B.; Cheng, M.; Park, K.-S.; Kaniskan, H. U.; Xiong, Y.; Jin, J. Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 2021, 21, 638−654.

(6) Lai, A. C.; Crews, C. M. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nat. Rev. Drug Discovery 2017, 16, 101−114.

(7) Schapira, M.; Calabrese, M. F.; Bullock, A. N.; Crews, C. M. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nat. Rev. Drug Discovery 2019, 18, 949−963.

(8) Schneider, M.; Radoux, C. J.; Hercules, A.; Ochoa, D.; Dunham, I.; Zalmas, L.-P.; Hessler, G.; Ruf, S.; Shanmugasundaram, V.; Hann, M. M.; Thomas, P. J.; Queisser, M. A.; Benowitz, A. B.; Brown, K.; Leach, A. R. The PROTACtable genome. Nat. Rev. Drug Discovery 2021, 20, 789−797.

(9) Garber, K. The PROTAC gold rush. Nat. Biotechnol. 2022, 40, 12−16.

(10) Mullard, A. Targeted protein degraders crowd into the clinic. Nat. Rev. Drug Discovery 2021, 20, 247−250.

(11) Sakamoto, K. M.; Kim, K. B.; Kumagai, A.; Mercurio, F.; Crews, C. M.; Deshaies, R. J. Protacs: Chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. P. Natl. Acd. Sci. USA 2001, 98, 8554−8559.

(12) Winter, G. E.; Buckley, D. L.; Paulk, J.; Roberts, J. M.; Souza, A.; Dhe-Paganon, S.; Bradner, J. E. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science 2015, 348, 1376−1381.

(13) Gesmundo, N. J.; Sauvagnat, B.; Curran, P. J.; Richards, M. P.; Andrews, C. L.; Dandliker, P. J.; Cernak, T. Nanoscale synthesis and affinity ranking. Nature 2018, 557, 228−232.

(14) Kitamura, S.; Zheng, Q.; Woehl, J. L.; Solania, A.; Chen, E.; Dillon, N.; Hull, M. V.; Kotaniguchi, M.; Cappiello, J. R.; Kitamura, S.; Nizet, V.; Sharpless, K. B.; Wolan, D. W. Sulfur(VI) Fluoride Exchange (SuFEx)-Enabled High-Throughput Medicinal Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142,10899−10904.

(15) Murray, J. B.; Roughley, S. D.; Matassova, N.; Brough, P. A. Off Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance. An Efficient Method to Kinetically Sample Hit to Lead Chemical Space from Unpurified Reaction Products. J. Med. Chem. 2014, 57, 2845−2850.

(16) Tang, W.; Luo, T.; Greenberg, E. F.; Bradner, J. E.; Schreiber, S. L. Discovery of histone deacetylase 8 selective inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 2601−2605.