TCGA中GBM的RNA

找出胶质细胞瘤特异性甲基化区域，为临床诊断提供理论依据

步骤： 1、查找数据：下载TCGA中GBM的RNA-seq和甲基化数据 2、甲基化数据分析，正常肿瘤对比，进行差异甲基化分析，找出肿瘤样本中高甲基化区域 3、对RNA-seq数据进行分析，正常肿瘤对比，差异表达基因的筛选，找出肿瘤样本中低表达基因。 4、结合甲基化和RNA-seq数据，将高甲基化和低表达基因取交集，这些基因很可能属于抑癌基因，与抑癌基因取交集，再结合promoter区域的CpG整合分析，寻找候选靶标。 5、对找出的靶标进行验证，利用pubmed以及其他数据库，反向验证靶标的

可靠性

一、数据下载

首先进入TCGA下载数据GBM的RNA-seq和甲基化数据，从下表可见GBM共有172套RNA-seq数据以及437套DNA甲基化数据，由于TCGA提供Infinium HumanMethylation27 BeadChip和Infinium HumanMethylation450 BeadChip两种芯片平台的数据，为了避免后续不同芯片平台间数据合并的困难，仅下载HumanMethylation450的芯片数据，共计154套。

图表 1TCGA数据汇总

二、初步整理数据

使用TCGA-Assembler.2.0.5进行GBM数据批量下载与初步整理，并且绘制RNA-seq 基因表达量盒型 图 以及甲基化芯片数据盒型图 ，由于数据量较大，此处不贴图。

三、整体可视化

首先对于甲基化数据，选取ID为TCGA.06.AABW.11A.31D.A368.05的数据，查看总体甲基化程度。由于每个位点真实情况只存在：甲基化/非甲基化两种，所以对全部位点甲基化程度进行统计，也应该是大部分位点处于“完全甲基化”(Methylation state=1)和“完全非甲基化”(Methylation state=0)两种状态，下图绘制了数据的频数柱状图，可以明显看出形状处于“两头高，中间低”，反向说明芯片数据质量较好。

图表 2单个样本CpG甲基化程度统计

接下来，对多个样本绘制CpG甲基化程度小提琴图，同一行是同一个病人，左边样本来源于Primary Solid Tumor，右边样本来源于Recurrent Solid Tumor，除了甲基化程度大部分分布于0和1附近外，还能看出来源于同一病人肿瘤的甲基化程度依旧会有略微差异。

TCGA barcode：https://wiki.nci.nih.gov/display/TCGA/TCGA+barcode

图表 3小提琴图

同样的，对于RNA-seq数据也可以进行一些初步可视化，除了数据下载后绘制的盒型图，亦可以进行PCA初步查看数据分布，下图左为PCA陡坡图，反映了第一主成分、第二主成分…等等所拥有信息量的比例，下图右为使用PCA1和PCA2绘制的散点图，可以发现5个正常样本距离较近，从侧面反映数据可信度较好。

最后，对于RNA-seq表达谱数据，使用系统聚类方法，绘制树状图，可以发现5个正常样本距离也是很近，数据质量还行。

四、差异甲基化区域筛选

为了更加科学高效地筛选差异甲基化位点，参考bioconductor中甲基化芯片的分析流程，使用minfi包进行差异甲基化分析，得到差异甲基化位点。

http://www.bioconductor.org/help/workflows/methylationArrayAnalysis/

在检测的526733个CpG位点中，共有4927个CpG位点P值 40.00

Length > 100

CpG island详细信息: Length 101 (1086..1186) Length 105 (1366..1470)

这七个CpG基本都在CpGisland中，具体序列见附录

九、靶标基因相关讨论

进入Gene数据库搜索NUAK1相关内容，可以发现基因全称NUAK family kinase 1，还是个激酶，激酶的话就对调控会有很大作用了，而在HPA RNA-seq normal tissues项目中，又看出来这个激酶在脑中表达量明显高于其他组织，这又与发生在脑部的GBM不谋而合。

图表 12 NUAK1相关讨论

十、分子机制探讨

对于肿瘤组织中高甲基化CpG附近的，并且在肿瘤样本中低表达的intersect共计274个基因，使用Gene Ontology进行富集分析，可以明显发现在GO biological process生物学过程中的“神经系统发育”、“化学性突触传递”和“细胞膜的组织”等部分里面有着富集，特别是“中枢神经系统的髓鞘形成”，富集程度达到26.95倍，这又与研究的多发生于脑补的GBM有着密切的联系，反向验证实验结果的正确性。

图表 13 GO富集分析

十一、FurtherMore

根据生物学知识可以得到，CpG的甲基化会调控基因的转录，因此，Transcript Start Site(TSS)附近的甲基化程度值得进行一番深入研究，选用人类基因组hg19版本，对23056基因共计46489个转录起始位点，进行转录起始位点富集甲基化程度统计。

统计TSS前后5000bp内CpG甲基化程度，并且使用曲线进行拟合，可以发现TSS处的CpG Methylation水平明显降低，这也与科学常识相吻合。

图表 14 TSS附近甲基化程度