RIG

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年6月20提交的美国临时专利申请号62/687,606、2018年10月9日提交的美国临时专利申请号62/743,369以及2019年3月8日提交的美国临时专利申请号62/815,870的优先权，其全部通过引用以其整体并入本文。

背景技术

视黄酸诱导基因1(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)和遗传与生理学实验室蛋白2(LGP2)构成了RIG-I样受体(RLR)类细胞内模式识别受体(PRR)。受体通过识别细胞质中的外源RNA并通过促炎性细胞因子和I型干扰素的产生引起先天性免疫应答，来抵御细菌和病毒感染。

RIG-I识别自身和非自身的RNA，包括正链和负链RNA病毒、RNA聚合酶III产生的来自如埃巴病毒之类的DNA病毒或富含AT的双链DNA模板的RNA片段、抗病毒内切核糖核酸酶RNA酶L的RNA裂解产物、合成的聚I:C以及甚至缺少5’-三磷酸的RNA适配体。RIG-I独特的病原体相关分子模式(PAMP)被定义为包含5’-三磷酸部分的双链体RNA，尽管仅双链体RNA对于RIG-I识别似乎是绝对需要的。

在本领域中仍然需要用于治疗、改善或预防癌症的组合物和方法。在某些实施方式中，这些组合物应该能够激活患病受试者中针对癌症的免疫力。本发明满足了本领域中的这种需求。

发明内容

一方面，本发明提供了治疗或预防受试者的癌症的方法。在某些实施方式中，方法包括向受试者施用治疗有效量的RIG-I激动剂。在其他实施方式中，进一步向受试者施用治疗有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4阻断剂或抗体。在另一方面，本发明提供了包含免疫检查点抑制剂和RIG-I激动剂的药物组合物。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的选定实施方式的以下详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了非限制性实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施方式的精确布置和手段。

图1包括图解了人细胞系(显示为293T)中荧光素酶报告基因系统中的干扰素诱导的柱状图；SLR14，SEQ ID NO:1和SLR10，SEQ ID NO:5。

图2包括图解了某些合成SLR在整个动物中诱导大量的IFN反应，并伴随诱导RIG-I特异性细胞因子的图。X-轴代表用如图例所示的各种RNA激动剂治疗的不同的小鼠组。

图3图解了使用YUMMER黑色素瘤细胞系的体内研究，其显示了SLR14作为单一药剂具有有效的抗肿瘤作用。

图4图解了使用YUMMER黑色素瘤细胞系的体内研究，其显示了SLR14的抗肿瘤作用需要T细胞和B细胞。RAG敲除小鼠没有T细胞或B细胞，并且在SLR14注射后这些小鼠没有受到YUMMER的保护。

图5图解了如何在小鼠远位(abscopal)肿瘤模型中评估SLR-RG的功效。

图6图解了树突细胞中SLR的非限制性作用机制。

图7图解了体内研究的某些结果，其中具有YUMMER黑色素瘤异种移植(xenograph)的B6小鼠用SLR14和/或抗PD1疗法共同治疗。

图8图解了体内研究的某些结果，其中具有YUMMER 1.7黑色素瘤异种移植的B6小鼠用SLR14和/或抗PD1疗法共同治疗。

图9包括如图8中概括的每个不同小鼠组的个体肿瘤体积测量。

图10图解了如下发现：具有SLR14治愈肿瘤的小鼠具有对肿瘤再攻击的记忆应答。

图11图解了在用相同或不同肿瘤攻击后小鼠中的某些肿瘤生长曲线。

图12是图解与本发明选定的SLR接触的HEK-293T细胞中的干扰素应答的图。

图13A-13B是图解底部链上的3’突出端对RIG-I的结合和信号传导的影响的一组图。

图13A：FL RIG-I的电泳迁移率转移测定(EMSA)的拟合曲线，其中5’-ppp/OH平端和3’-突出端的RNA在底部链上。表征(featured)：SEQ ID NO:15-16。图13B：IFN-β诱导测定，其中携带3’-突出端的SLR-10和其变体在底部链上。在两个图板中所示的RNA序列中，N＝0、1、2、3或5。表征：SEQ ID NO:17。

图14A-14D是图解顶部链上的5’突出端对RIG-I的结合和信号传导的影响的一组图和方案。图14A：在EMSA测定中使用的具有5’突出端的RNA双链体的图示。N＝0、1、2、3和5。表征：SEQ ID NO:15-16。图14B：FL RIG-I的EMSA测定的拟合曲线，其中5’-ppp平端和5’-突出端的RNA在顶部链上。图14C：RIG-I-ΔCARD的EMSA测定的拟合曲线，其中5’-ppp平端和5’-突出端的RNA在顶部链上。图14D：IFN-β诱导测定，其中携带5’-突出端的SLR-10和其变体在顶部链上。OH-SLR-10是不具有5’-ppp基团的发夹RNA。表征：SEQ ID NO:17。

图15A-15D图解了以下发现：肿瘤内注射SLR14在YUMMER 1.7黑色素瘤中产生显著的抗肿瘤作用。图15A：皮下(s.c.)注射100μl PBS中1×10

图16A-16C图解了以下发现：与单一治疗相比，SLR14和抗PD1的联合治疗导致更好的抗肿瘤作用。图16A：s.c.注射100μl PBS中5×10

图17A-17E图解了以下发现：SLR14主要在肿瘤微环境中被CD11b+髓样细胞摄取。图17A：s.c.注射100μl PBS中5×10

图18A-18D图解了以下发现：肿瘤内SLR14递送增强了细胞毒性T淋巴细胞和髓样细胞的肿瘤浸润。在C57BL/6J小鼠中建立YUMMER1.7黑色素瘤并用SLR14和载体进行治疗，如图15A中所描述的。持续SLR14治疗3天后，收获肿瘤并用0.5mg/ml胶原酶D和40μg/ml DNA酶I进行消化。单细胞悬浮液用于流式细胞术分析。图18A-18B：每组中浸润肿瘤的CD45+、B220+、NK1.1+、CD8+、CD4+、FoxP3+CD4+、CD11b+或Ly6G+CD11b+细胞的百分比(上部)和数量(下部)。所有T细胞为CD44+。基于肿瘤重量标准化细胞数目。图18B：每组中浸润肿瘤的CD8+T细胞/CD4+T细胞或CD8+T细胞/CD4+FoxP3+调节T(Treg)细胞的比例。图18C：CD8+/CD4+比例和CD8+/CD4+Treg比例。图18D：荷YUMMER1.7的RAG1-/-小鼠的肿瘤生长曲线。将5×10

图19A-19E图解了以下发现：SLR14表现了B16F10黑色素瘤中稳固的抗肿瘤作用。图19A：将100μl PBS中1×10

图20A-20B图解了以下发现：B16F10黑色素瘤中SLR14的抗肿瘤作用部分由T细胞介导。图20A：将100μl PBS中5×10

图21A-21B图解了以下发现：肿瘤内SLR14递送诱导对未治疗的远距离肿瘤的有效远位作用。图21A：将5×10

图22A-22B图解了以下发现：肿瘤内SLR14递送诱导MC38结肠癌中有效的抗肿瘤作用。将100μl PBS中5×10

具体实施方式

本发明提供了用于激活对抗癌症的免疫性的组合物和方法。在一方面，本发明提供了诸如但不限于茎环RNA(SLR)的某些RIG-I激动剂作为免疫疗法。

先天性免疫激动剂构成了强大的抗肿瘤策略。激活先天免疫受体“加热(warmup)”肿瘤细胞(即增加免疫系统细胞的肿瘤浸润)，这触发T细胞募集的自然过程，并激发适应性免疫系统识别并消灭肿瘤。在某些实施方式中，先天性免疫激动剂补充检查点抑制剂。先天性免疫激动剂增强检查点阻断剂的功效，并且对于加热对检查点疗法无应答的“冷肿瘤”特别有用。先天性免疫激动剂激活整个免疫系统。因此，每个检查点阻断剂都可以与伴随的先天性刺激物，诸如本发明的RIG-I激动剂一起使用。

激活肿瘤内的先天免疫系统是免疫疗法中有希望的方法，因为它可以用于治疗广泛的肿瘤亚型，并且确保整个肿瘤微环境中的细胞变得敏化，这导致T细胞的攻击和破坏。RIG-I是肿瘤中先天免疫应答的普遍而敏感的触发物，因此该受体的激动剂是有希望的免疫疗法药剂。

原则上，STING(诸如环状二核苷酸类似物；Merck MK-1454或Aduro/NovartisAdu-S100)、TLR9(诸如CpG DNA聚合物或CpGs；Checkmate CMP-001或Idera IMO-2125)和RIG-I(诸如三磷酸化双链RNA(dsRNA)；Merck/Rigontec RGT100)的激动剂可以用作先天免疫激动剂。STING和TLR9激动剂具有某些不利因素，诸如适用于有限组的肿瘤亚型，而快速突变提示潜在的抗性问题。此外，STING激动剂引发相当弱的免疫应答，并且现在与转移的诱导有关。dsRNA是效力不及SLR的长的双链分子。dsRNA的稳定性和歧化降低可激活其他先天性免疫受体，导致炎性作用。进一步，双链分子具有其自身的制造不利因素。

另一方面，RIG-I在大多数肿瘤中广泛分布并表达。鉴于该基因的患者突变少，RIG-I抗性不太可能。SLR不诱导高TNF水平或其他广泛的炎性ISG和细胞因子。SLR是定义明确的合成化合物，其可以容易地大规模地合成。SLR比dsRNA或病毒激动剂更小且更稳定。

可以触发诸如cGAS-STING和RIG-I-MAVS的胞质核酸感测途径来增强对癌症的免疫应答。如本文所证明的，测试了独特的RIG-I特异性激动剂茎环RNA14(SLR14)的体内抗肿瘤活性。当肿瘤体积达到40-80mm

公开内容

在某些实施方式中，本发明的RIG-I激动剂暴露(unmask)肿瘤，因此它们受到杀伤T细胞攻击。在其他实施方式中，本发明的RIG-I激动剂加热“冷”肿瘤(即，免疫系统的细胞团较差渗透的肿瘤)，因此检查点阻断剂更有效。在仍其他实施方式中，本发明的RIG-I激动剂针对转移为荷肿瘤生物体接种疫苗。

在某些实施方式中，本发明的RIG-I激动剂选择性激活RIG-I先天性免疫传感器(sensor)。在其他实施方式中，本发明的RIG-I激动剂是茎环RNA。国际专利申请公开号WO/2014/159990和美国专利申请公开号US2016/0046942的公开内容通过引用以其全部并入本文。

本文描述的组合物和方法可以激活任何PRR，其包括但不限于RIG-I样受体(RLR)类PRR，其包括RIG-I、MDA5和LGP2；NOD-样受体(NLR)、C-型凝集素受体(CLR)和toll样受体(TLR)。

在某些实施方式中，本发明提供了核酸分子。本公开中使用的示例性核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、锁核酸(LNA)或其杂交物。如本文所描述，本发明的核酸分子不依赖于特定核苷酸序列。而是，可以使用任何核苷酸序列，条件是该序列具有形成本文描述的核酸分子的结构的能力。

在某些实施方式中，本发明的核酸分子包括双链区。

在某些实施方式中，核酸分子是双链的双链体。在其他实施方式中，核酸分子包括双链的双链体。在仍其他实施方式中，核酸分子基本上由双链的双链体组成。在仍其他实施方式中，核酸分子由双链的双链体组成。在仍其他实施方式中，包括双链的双链体的分子包括一个平端。在仍其他实施方式中，包括双链的双链体的分子包括两个平端。在仍其他实施方式中，包括双链的双链体的分子包括一个3’-突出端。在仍其他实施方式中，包括双链的双链体的分子包括两个3’-突出端。在仍其他实施方式中，包括双链的双链体的分子包括一个5’-突出端。在仍其他实施方式中，包括双链的双链体的分子包括两个5’-突出端。在仍其他实施方式中，包括双链的双链体的分子包括一个5’-突出端和一个3’-突出端。

在某些实施方式中，本发明的核酸分子是单链分子，其中分子的第一区与分子的第二区杂交以形成双链区段，其通过环连接。在仍其他实施方式中，核酸分子的发夹结构提高双链区段的稳定性。在仍其他实施方式中，发夹环包括非脱氧核苷酸，诸如但不限于单、二或聚乙二醇，或其他非脱氧核苷酸接头。在仍其他实施方式中，核酸分子包括平端。在仍其他实施方式中，核酸分子包括两个平端。

在某些实施方式中，核酸分子具有至少一个3’-突出端。在其他实施方式中，3’-突出端包括非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括两个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括三个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括四个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括五个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括六个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括七个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括八个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括九个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括十个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括多于十个非碱基配对核苷酸。

在某些实施方式中，核酸分子具有至少一个5’-突出端。在其他实施方式中，分子内结构产生5’-突出端。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括两个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括三个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括四个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括五个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括六个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括七个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括八个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括九个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括十个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括多于十个非碱基配对核苷酸。

在其他实施方式中，核酸分子包括5’-三磷酸或5’-二磷酸基团。在仍其他实施方式中，一个或多个5’-三磷酸或5’-二磷酸基团的存在提高核酸分子与RIG-I的结合亲和力。

在某些实施方式中，SLR的核酸酶抗性可以利用主链修饰(如，硫代磷酸酯和/或2’-脱氧-2’-氟核苷酸和/或2’-修饰的核苷酸，如本文其他地方描述的和或本领域已知的)和5’-末端修饰和/或3’-末端修饰进行增强。在其他实施方式中，SLR可以标记有示踪剂，诸如荧光团、同位素等，其通过固相合成容易地并入末端环中。

在某些实施方式中，SLR可以使用提高其稳定性和或靶向的递送载体体内递送。在其他实施方式中，SLR肿瘤内递送。在仍其他实施方式中，SLR全身递送。

本发明的SLR强烈地激活RIG-I并刺激细胞内稳固的IFN应答。在非限制性实例中，图1图解了人细胞系(显示为293T)中荧光素酶报告基因系统中的干扰素诱导。

进一步，合成SLR在整个动物中诱导大量IFN应答，伴随诱导RIG-I特异性细胞因子(参见，图2)。敲除和敲低实验指示RIG-I特异性。重要地是，SLR不诱导广泛的炎性作用或毒性，这指示了低TNF激活。

体内研究显示了，SLR14(SEQ ID NO:1)作为单一药剂具有有效的抗肿瘤作用(参见，图3)。进一步，SLR14的抗肿瘤作用需要T和B细胞(参见，图4)。

在某些实施方式中，本发明提供了用于治疗癌症的组合物和方法，所述癌症包括但不限于血液恶性肿瘤——其包括各种白血病和淋巴瘤、癌、母细胞瘤、黑色素瘤和肉瘤。

如本文所使用，免疫疗法指导致针对患者中某些癌症增加免疫应答的任何疗法。在某些实施方式中，免疫疗法干扰或阻断现有阴性信号或抑制信号，该现有阴性信号或抑制信号正起作用以避免或减少免疫应答的大小。作为一个非限制性实例，程序性细胞死亡蛋白1(PD1；也称为CD279)具有至少两个已知的配体：程序性细胞死亡1配体1(PD-L1；也称为CD274和B7-H1)和程序性细胞死亡1配体2(PD-L2；也称为CD273和B7-DC)。在免疫效应细胞上表达的PD1和其配体中一个或多个之间的相互作用导致免疫效应细胞的免疫活性降低。因此，在某些实施方式中，免疫疗法涉及通过干扰PD1与其配体中的至少一种的相互作用，和/或通过抑制PD1、PD-L1、PD-L2和其组合中的至少一种，治疗性干预通过PD1的信号传导。因此，治疗性干预通过PD1的信号传导用于增强T细胞介导的免疫应答，诸如针对癌症定向的那些。这类治疗性干预在文献中有时被称为PD1阻断。

在某些实施方式中，治疗性干预通过PD1的信号传导包括小分子药物、多肽、或抗体或其片段(诸如但不限于在Brahmer et al.,2012,N.Engl.J.Med.,366(26):2455-65；Topalian et al.,2012,N.Engl.J.Med.,366(26):2443-54中叙述的那些)，其干扰PD1预其配体中至少一种的相互作用，和或抑制PD1、PD-L1和PD-L2中的至少一种。

可用于通过干扰或抑制PD1、PD-L1和PD-L2中的至少一种治疗性干预通过PD1的信号传导的组合物的实例包括但不限于AMP224或GSK2661380(Medimmune/GSK)；阿替唑珠单抗(MPDL3280A、RO5541267；Genentech/Roche)；阿维鲁单抗(Merck KGaA)；BMS936559(或MDX1105；Bristol-Myers Squibb)；德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736；Medimmune/AstraZeneca)；纳武单抗(ONO-4538,BMS-936558,MDX1106；Bristol-Myers Squibb)；派姆单抗(MK3475；Merck)；匹地丽珠单抗(pidilizumab)(CT011；CureTech Ltd.)；和RG7446(F.Hoffmann-La Roche Ltd.)。

可用于治疗性干预通过CTLA4的信号传导的组合物的实例包括但不限于伊匹单抗(BMS-734016,MDX-010,MDX-101；Bristol-Myers Squibb)和替西木单抗(ticilimumab，CP-675,206；MedImmune LLC)。

可用于免疫疗法的组合物的其他实例包括但不限于lirilumab(BMS986015,IPH2102；Bristol-Myers Squibb)；IMP321(Prima Biomed)；和enoblituzumab(MGA271；MacroGenics)。

本领域技术人员将理解，本发明不限于本文讨论的示例性免疫疗法。此外，本领域技术人员将理解，可以单独或以任何组合形式施用一种或多种免疫疗法。更进一步，本领域技术人员将理解，可以将一种或多种免疫疗法与任何其他类型的疗法(包括化学疗法)联合施用。

定义

如本文所用，以下每个术语具有与其在本章节中相关的含义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。通常，本文所用的命名法以及动物药理学、药物科学、分离科学和有机化学中的实验室程序是本领域众所周知的和常用的。应当理解，只要本教导仍然可操作，步骤的顺序或用于执行某些动作的顺序就无关紧要。章节标题的任何使用均旨在帮助阅读文档，而不应解释为限制性的；与章节标题相关的信息可能发生在该特定章节之内或之外。该文档中引用的所有出版物、专利和专利文件都通过引用以其整体并入本文，就像通过引用将其单独并入一样。

在本申请中，当提到要素或组分被包括在所列举的要素或组分的列表中和/或从所列举的要素或组分的列表中选择时，应当理解，该要素或组分可以是所列举的要素或组分中的任何一个，并且可以选自所述要素或组分中两个或更多个。

在本文描述的方法中，可以以任何顺序执行动作，除非明确地陈述了时间或操作序列。此外，指定的动作可以同时执行，除非明确的声明语言陈述了它们是分开执行的。例如，可以在单个操作中同时执行要求保护的X动作和要求保护的Y动作，并且所得过程将落入要求保护的过程的文字范围内。

在本文中，除非上下文另外明确指出，否则术语“一种”，“一个”或“该”用于包括一个或多个。除非另有说明，否则术语“或”用于表示非排他性的“或”。陈述“A和B中的至少一个”或“A或B中的至少一个”与“A、B或A和B”具有相同的含义。

如本文中所使用的，术语“约”将被本领域普通技术人员理解，并且将在使用它的上下文中以某种程度变化。如本文中所使用的，当指代诸如量、时间段之类的可测量值时，“约”旨在涵盖偏离指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，因为这样的变化适合执行所公开的方法。

如本文所用，短语“远位作用”是指这样的现象，其中在患有多于一种肿瘤的受试者中，未治疗的肿瘤的缩小与局部治疗范围内的肿瘤的缩小同时发生。术语“远位作用”涵盖所有类型的局部治疗，例如放射疗法、电穿孔和肿瘤内注射治疗剂。在某些实施方式中，该短语不适用于抗癌疗法的全身应用。

如本文所用，术语“癌症”定义为特征在于异常细胞快速且不受控制的生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

“互补的”是指两个核酸链的区之间或同一核酸链的两个区之间的序列互补性的广义概念。已知第一核酸区的腺嘌呤残基能够与和第一区反平行的第二核酸区的残基(如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特异性氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与和第一链反平行的第二核酸链的残基(如果该残基是鸟嘌呤)碱基配对。如果当两个区以反平行方式排列时，第一区的至少一个核苷酸残基能够与第二区的残基碱基配对，则核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补。在某些实施方式中，第一区包括第一部分，和第二区包括第二部分，由此，当第一部分和第二部分以反平行方式布置时，第一部分的核苷酸残基的至少约50％，和优选至少约75％、至少约90％或至少约95％能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。在某些实施方式中，第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分的核苷酸残基碱基配对。

“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定的核苷酸序列的固有性质——在生物过程中用作合成具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板，以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录模板的非编码链都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

如本文所用，应用于核酸的术语“片段”是指较大核酸的子序列。核酸的“片段”的长度可以为至少约5个核苷酸；例如，至少约10个核苷酸至约100个核苷酸；至少约100至约500个核苷酸，至少约500至约1000个核苷酸，至少约1000个核苷酸至约1500个核苷酸；或约1500个核苷酸至约2500个核苷酸；或约2500个核苷酸(及其之间的任意整数)。

本文所用的“同源的、同源性”或“同一的、同一性”是指氨基酸和核酸序列之间的比较。当提及核酸分子时，“同源性”、“同一性”或“同一百分比”是指通过序列分析程序本发明核酸序列的核苷酸与同一的核苷酸匹配的百分比。同源性可以通过已知方法容易地计算。可以使用计算机程序比较核酸序列和氨基酸序列，所述计算机程序将核酸或氨基酸的相似序列进行比对，并从而确定差异。在示例性方法中，采用了BLAST程序(NCBI)和其中使用的参数，并且使用ExPaSy来比对基因组DNA序列的序列片段。但是，可以通过使用任何标准的比对软件来获得等效的比对评估。

如本文所用，“同源的”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子之间，例如两个DNA分子或两个RNA分子之间或两个多肽分子之间的亚基序列相似性。当两个分子中两个亚基的位置都被同一亚基占据时——例如如果两个DNA分子中的每个的位置被腺嘌呤占据，那么它们在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数，例如，如果两个化合物序列中一半(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列为50％同源性，如果位置中的90％(如10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列具有90％的同源性。举例来说，DNA序列5’-ΑTTGCC-3’和5’-TATGGC-3’具有50％的同源性。

“杂交探针”是能够以碱基特异性的方式与核酸的互补链结合的寡核苷酸。这样的探针包括如Nielsen et al.,1991,Science 254:1497-1500中所描述的肽核酸，以及其他核酸类似物和核酸模拟物(参见美国专利号6,156,501)。

术语“杂交”是指其中两个单链核酸非共价结合形成双链核酸的过程；从理论上讲，三链杂交也是可行的。核酸中的互补序列彼此配对以形成双螺旋。所得的双链核酸是“杂交物(杂化物，hybrid)”。杂交可以在例如两个互补或部分互补的序列之间。杂交物可以具有双链区和单链区。杂交物可以是例如DNA：DNA、RNA：DNA或DNA：RNA。杂交物也可以在修饰的核酸之间形成。可以将一种或两种核酸固定在固体支持物上。杂交技术可用于检测和分离特定序列、测量同源性或限定一条或两条链的其他特性。

杂交物的稳定性取决于多种因素，其包括互补长度、互补区内错配的存在、反应中盐的温度和浓度。杂交通常在严格的条件下进行，例如，在不超过1M的盐浓度和至少25℃的温度下。例如，5X SSPE(750mM NaCl、50mM磷酸钠、5mM EDTApH 7.4)或100mM MES、1M NaCl、20mM EDTA、0.01％Tween-20和25-50℃的温度的条件适用于等位基因特异性探针杂交。在示例性实施方式中，杂交在40-50℃下进行。乙酰化的BSA和鲱精DNA可以添加到杂交反应中。适用于微阵列的杂交条件在《基因表达技术手册》(Gene Expression TechnicalManual)和《基因芯片作图分析手册》(GeneChip Mapping Assay Manual)(可从Affymetrix(Santa Clara,CA)购得)中进行了描述。

如果两个寡核苷酸在仅至少约75％、优选至少约90％或至少约95％互补的寡核苷酸彼此复性的条件下复性，则第一寡核苷酸与第二寡核苷酸以“高严格性”复性。用于使两个寡核苷酸复性的条件的严格性是温度、复性介质的离子强度、温育时间、寡核苷酸的长度、寡核苷酸的GC含量以及两个寡核苷酸之间的非同源性的预期程度(如果已知的话)等因素的函数。调节复性条件的严格性的方法是已知的(参见，如，Sambrook et al.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

如本文所用，如果癌症或肿瘤在受癌症或肿瘤困扰的受试者中诱导免疫应答，则其是“免疫原性的”。癌症抗原可以是TSA(肿瘤特异性抗原)或TAA(肿瘤相关抗原)。肿瘤特异性抗原是仅存在于肿瘤细胞中的抗原。肿瘤相关抗原存在于健康细胞中，但由于一些原因，它们也发生于肿瘤细胞中，但表达的数量、位置或时间段不同。非免疫原性肿瘤可能缺乏TSA或TAA。肿瘤细胞已发展出多种逃避免疫监视的机制，并从而成为“非免疫原性”或“不是免疫原性的”。CD8+细胞毒性T细胞是抗肿瘤免疫力的基本成分，识别癌细胞MHC I类呈递的抗原。但是，一些癌细胞降低其MHC I表达，并避免被细胞毒性T细胞检测到。其他肿瘤细胞通过停止共刺激细胞毒性T细胞所必需的分子(例如CD80或CD86)的表达而变为非免疫原性的。而且，肿瘤细胞可通过接触依赖性或非依赖性刺激来诱导调节性T细胞的产生。在健康的组织中，功能正常的Treg对于维持自我耐受是必需的。然而，在肿瘤中，Treg形成免疫抑制性微环境。可选地，如果没有T细胞进入肿瘤块，则该肿瘤可以是非免疫原性的。例如，如果肿瘤组织中的脉管系统有缺陷或渗漏，可能会发生这种情况，从而使T细胞的正常迁移过程无法发生。

如本文所用，“说明材料”包括在实现本文所述的各种疾病或紊乱减轻的试剂盒中的出版物、记录、图表或可用于传达本发明的化合物、组合物、载体或递送系统的有用性的任何其他表达介质。任选地或可选地，说明材料可以描述一种或多种减轻哺乳动物细胞或组织中的疾病或紊乱的方法。例如，本发明试剂盒的说明材料可以固定在包含本发明的鉴定的化合物、组合物、载体或递送系统的容器上，或者与包含鉴定的化合物、组合物、载体或递送系统的容器一同运送。可选地，说明材料可以与容器分开地运送，目的是说明材料和化合物由接收者协同使用。

如本文所用，“分离物”是指从个体获得的或从获得自个体的样品获得的核酸。核酸可以在获得后的任何时间进行分析(如，在实验室培养之前或之后、扩增之前或之后)。

如本文所用，术语“标签”是指发光标签、光散射标签或放射性标签。荧光标签包括但不限于市售的荧光素亚磷酰胺，诸如Fluoreprime(Pharmacia)、Fluoredite(Millipore)和FAM(ABI)。参见，美国专利号6,287,778，其通过引用以其整体包括在本文中。

术语“错配”、“错配对照”或“错配探针”是指其序列与特定靶序列不完美互补的核酸。错配可包含一个或多个碱基。如本文所用，术语“核酸”是指天然存在的分子例如DNA和RNA，还指各种衍生物和类似物。通常，本教导的探针、发夹接头和靶多核苷酸是核酸，并且通常包括DNA。如本领域普通技术人员将理解的，可以采用其他衍生物和类似物。

如本文所用，术语“核苷酸碱基”是指取代或未取代的一个或多个芳环。在某些实施方式中，一个或多个芳环包含至少一个氮原子。在某些实施方式中，核苷酸碱基能够与适当互补的核苷酸碱基形成沃森-克里克和/或Hoogsteen氢键。示例性的核苷酸碱基及其类似物包括但不限于天然存在的核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、6-甲基-胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和天然存在的核苷酸碱基的类似物，如，7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、N

如本文所用，术语“核苷酸”是指包含连接至糖(如核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖及其糖类似物)的C-1’碳的核苷酸碱基的化合物。术语核苷酸还包括核苷酸类似物。糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖包括但不限于其中一个或多个碳原子(例如2’-碳原子)被一个或多个相同或不同的Cl、F、-R、-OR、-NR

术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。将理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，其还包括其中“U”代替“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。

如本文所用，术语“突出端(overhang)”是指由延伸超过与第一链或区形成双链体的互补链的末端的一条链或一个区产生的末端非碱基配对核苷酸(一个或多个)。能够通过氢键形成双链体的一个或多个多核苷酸可以具有突出端。延伸超过双链体的3’-端的单链区称为突出端。

如本文所用，术语“模式识别受体”(缩写为PRR)，是指通常识别病原体相关分子模式的蛋白质家族。PRR可以包括RIG-1样受体(RLR)家族、NOD样受体(NLR)家族、C型凝集素受体(CLR)家族或toll样受体(TLR)家族的成员。在某些实施方式中，本文所述的核酸分子与PRR结合，从而导致干扰素应答。应当理解，PRR包括任何PRR片段、变体、剪接变体、突变体等。在某些实施方式中，PRR为RIG-I。

如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸的常识，多核苷酸可被水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以被水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段和通过合成手段获得的所有核酸序列，所述本领域可用的任何手段包括但不限于重组手段，即使用普通的克隆和扩增技术等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的多核苷酸，其长度通常小于100个碱基。

本文使用常规符号描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5’-端。将具有与mRNA相同序列的DNA链称为“编码链”；DNA链上位于5’至DNA上参考点的序列被称为“上游序列”；DNA链上位于3’至DNA上参考点的序列被称为“下游序列”。

本领域技术人员将理解，本文中全部以其正向取向叙述的所有核酸序列，也以其反向取向以及以它们的正向和反向互补取向可用于本发明的组合物和方法中，并且在本文中进行了描述；以及是否它们在本文中明确叙述。

“引物”是指如此多核苷酸，其能够与指定的多核苷酸模板特异性杂交并提供用于合成互补多核苷酸的起始点。当将多核苷酸引物置于诱导合成的条件下，例如在核苷酸、互补多核苷酸模板和用于聚合的试剂(例如DNA聚合酶)的存在下，就会发生这种合成。引物通常是单链的，但也可以是双链的。引物通常是脱氧核糖核酸，但各种各样的合成引物和天然存在的引物可用于许多应用。引物与设计与其杂交以用作合成起始位点的模板互补，但不必反映模板的确切序列。在这种情况下，引物对模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。引物可以用可检测的标签(例如，生色、放射性或荧光部分)标记，并用作可检测的部分。荧光部分的实例包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、若丹明、荧光素、丹酰、藻红蛋白(phycocrytherin)、藻蓝蛋白、光谱橙、光谱绿和/或本文其他地方的实例的任何一种或多种的衍生物。其他可检测的部分包括洋地黄毒苷和生物素。

如本文所用，“探针”定义为能够通过一种或多种类型的化学键(通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成)与互补序列的靶核酸结合的核酸。如本文所用，探针可以包括天然的(即，A、G、U、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。另外，除磷酸二酯键以外的键可以连接探针中的碱基，只要它不干扰杂交。因此，探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键连接。术语“匹配”、“完美匹配”、“完美匹配探针”或“完美匹配对照”是指具有与特定靶序列完美互补的序列的核酸。核酸通常与靶序列的部分(子序列)完美互补。完美匹配(PM)探针可以是“测试探针”、“标准化对照”探针、表达水平对照探针等。但是，完美匹配对照或完美匹配区别于“错配”或“错配探针”。

如本文所用，术语“核糖核苷酸”和短语“核糖核酸”(RNA)是指包含至少一个核糖核苷酸单元的修饰的或未修饰的核苷酸或多核苷酸。核糖核苷酸单元包含附接到核糖基部分的2’-位置的氧，该核糖基部分在核糖基部分的1’-位置处具有附接至N-糖苷键的含氮碱基，以及允许与另一个核苷酸成键或排除键的部分。

如本文所用，术语“靶”是指对给定分子具有亲和力的分子。靶可以是天然存在的分子或人造的分子。而且，它们可以以其未改变的状态或作为与其他种类的聚集体使用。靶可以直接地或通过特异性结合物质共价或非共价地附接至结合成员。可以由本发明使用的靶的实例包括但不限于蛋白质、肽、寡核苷酸和核酸。

如本文所用，术语“变体”是分别不同于参考核酸序列或肽序列的核酸序列或肽序列，但是其保留了参考分子的基本特性。核酸变体的序列变化可能不会改变参考核酸编码的肽的氨基酸序列，或可能导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。核酸或肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者可以是未知天然存在的变体。核酸和肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或直接合成来制备。

范围：在整个本公开中，可以以范围格式来呈现本发明的各个方面。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围从1到6的描述应视为已明确公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。

化合物和组合物

在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有20个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有19个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有18个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有17个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有16个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有15个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有14个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有13个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有12个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有11个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有10个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有9个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有8个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有7个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有6个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，双链区段包括一个或多个错配对的碱基。即，沃森-克里克碱基配对不需要在每个和每一个核苷酸对处。在某些实施方式中，双链区段包括约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个碱基对。

在某些实施方式中，核酸分子可以具有任何序列并且包括发夹结构和平端。在某些实施方式中，发夹结构包括约6个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约7个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约8个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约9个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约10个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约11个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约12个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约13个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约14个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约15个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约16个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约17个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约18个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约19个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，发夹结构包括约20个碱基对的双链区段。

本发明的核酸分子包含来自任何来源的核酸，例如但不限于体外制备的、从细胞中分离的和/或体内合成的核酸。核酸的体内合成可以使用本领域已知的和/或本文讨论的任何方法来实现，诸如但不限于用能够在受试者中表达适当核酸序列的合成DNA或载体转染受试者。这样的实例将允许受试者中核酸的组成型内源性产生。

在本发明的上下文中，核酸包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、锁核酸(LNA)或其杂交物。

LNA，通常称为不可及的RNA，是修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被连接2’-氧和4’-碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3’-内(North)构象中，该构象通常在A型双链体中发现。LNA核苷酸可以在需要时与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合，并根据沃森-克里克碱基配对规则与DNA或RNA杂交。此类寡聚物可以化学合成并且可商购。锁定的核糖构象增强碱基堆积和骨架预组织化。

LNA包括具有碳或杂脂环的核酸单元——该碳或杂脂环具有4至6个环成员，如firanose环或其他脂环结构，诸如环戊基、环庚基、四氢吡喃基、氧杂环庚基(oxepanyl)、四氢硫代苯基、吡咯烷基、噻吩基(thianyl)、硫杂环庚基(thiepanyl)、哌啶基等。在某些实施方式中，碳或杂脂环基团的至少一个环原子被采用以形成另外的环状键，从而提供多环基团。环状键可以包括碳或杂脂环基团中的一个或多个，通常是两个原子。环状键也可以包括碳或杂脂环基团的一个或多个原子，该原子是取代基而不是环成员。LNA单元的实例包括含有呋喃糖基型环和以下键中一个或多个的那些单元：C-1’、C-2’；C-2’、C-3’；C-2’、C-4’；或C-2’、C-5’键。C-2’、C-4’是特别期望的。在其他实施方式中，LNA单元是在中间糖部分(如，核糖或木糖)的2’-位置上具有取代基的化合物，或其衍生物，其偏向通常被称为North(或简化为N)构象的C3’-内构象。示例性LNA单元包括2’-O-甲基、2’-氟、2’-烯丙基和2’-O-甲氧基乙氧基衍生物。其他期望的LNA单元在国际专利申请WO 99/14226、WO 00/56746和WO00/66604中进一步讨论，其全部以其整体包括在本文中。

DNA和RNA天然存在于生物体中，但是它们也可能存在于活生物体外部或可能添加到生物体中。核酸可以是任何来源的，如，病毒的、细菌的、古细菌的、真菌的、核糖体的、真核的或原核的。它可以是来自任何生物样品以及任何生物体、组织、细胞或亚细胞区室的核酸。它可以是来自任何生物体的核酸。核酸可以在定量之前进行预处理，如，通过分离、纯化或修饰。也可以使用人工或合成核酸。核酸的长度可以变化。核酸可以被修饰，如可以包含一个或多个修饰的核碱基或修饰的糖部分(如，包含甲氧基基团)。核酸的主链可以包含一个或多个肽键，如在肽核酸(PNA)中那样。核酸可包含碱基类似物，例如非嘌呤或非嘧啶类似物或核苷酸类似物。它还可能包含其他附接物，诸如蛋白质、肽和/或氨基酸。

在某些实施方式中，本发明的核酸分子是形成分子内结构(即发夹结构)的单链寡核苷酸。

在某些实施方式中，发夹核酸分子形成平端。在某些实施方式中，平端是指如，RNA双链体，其中双链体的至少一端缺少任何突出端，如，3’-二核苷酸突出端，使得5’-和3’-链端在一起，即是齐平的或在本文称为平头的(平的，blunt)。本发明的分子可以具有至少一个平端。在其他实施方式中，分子内结构产生3’-突出端。在某些例子中，3’-突出端包括非碱基配对核苷酸。在其他实施方式中，3’-突出端包括两个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括三个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，3’-突出端包括四、五、六、七、八、九、十或多于十个非碱基配对核苷酸。在某些例子中，分子内结构产生5’-突出端。在某些实施方式中，5’-突出端包括非碱基配对核苷酸。在其他实施方式中，5’-突出端包括两个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括三个非碱基配对核苷酸。在仍其他实施方式中，5’-突出端包括四、五、六、七、八、九、十或多于十个非碱基配对核苷酸。

在某些例子中，本发明的短发夹核酸分子是理想的刺激物，因为在解链后具有重新复性的能力，而不是发夹的较短回文双链体则可能一旦双链体解链就失去了刺激IFN产生的能力。然而，本发明不限于发夹结构，如本文所证明的，短的双链的双链体证明了结合PRR和刺激干扰素应答的能力。

在一些例子中，设计本发明的短发夹核酸分子，使得在一些条件下，分子内茎结构在茎结构未折叠的情况下具有降低的稳定性。以这种方式，可以设计茎结构，使得可以解除茎结构的分子内碱基配对并且类似于线性分子。

根据本发明，提供了预定的茎寡核苷酸序列，其包含形成茎结构的互补序列的一段序列。在某些实施方式中，茎包括双链区段，其包括20个碱基对、19个碱基对、18个碱基对、17个碱基对、16个碱基对、15个碱基对、14个碱基对、13个碱基对、12个碱基对、11个碱基对、10个碱基对、9个碱基对、8个碱基对、7个碱基对或6个碱基对，使得这些互补的一段序列复性以提供发夹结构。在某些实施方式中，双链区段包括一个或多个碱基错配。即，双链区段不需要在每个或每一个碱基对处包括沃森-克里克碱基配对，从而产生发夹结构。

在某些实施方式中，本发明的短发夹核酸分子包括：反义序列和有义序列，其中有义序列与反义序列基本上互补；和连接反义和有义序列的环区或接头。

在某些方面，本发明包括多核苷酸，其包括单分子RNA，诸如短发夹RNA。短发夹RNA可以是单分子RNA，其包括有义序列、环区或接头以及反义序列，它们一起形成发夹环结构。优选地，反义和有义序列彼此基本上互补(约80％互补或更多)，其中在某些实施方式中，反义和有义序列彼此100％互补。在某些实施方式中，反义和有义序列各自包括20个碱基对、19个碱基对、18个碱基对、17个碱基对、16个碱基对、15个碱基对、14个碱基对、13个碱基对、12个碱基对、11个碱基对、10个碱基对、9个碱基对、8个碱基对、7个碱基对或6个碱基对。另外地，本发明的单分子RNA内的反义和有义序列可以具有相同的长度或不同的长度。环可以是任何长度，例如，长度是0、1或更多、2或更多、4或更多、5或更多、8或更多、10或更多、15或更多、20或更多、40或更多、或100或更多个核苷酸长度。

在某些方面，接头不含核苷、核苷酸、脱氧核苷或脱氧核苷酸或其任何替代物或修饰。在某些实施方式中，接头不含磷酸主链或其任何替代物或修饰。

本文考虑了本领域已知的任何接头。接头的非限制性实例包括乙二醇(-CH

在某些实施方式中，接头包括至少一个乙二醇基团。在其他实施方式中，接头包括一个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括两个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括三个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括四个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括五个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括六个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括七个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括八个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括九个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括十个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括多于十个乙二醇基团。在仍其他实施方式中，接头包括(OCH

在某些实施方式中，接头包括至少一个氨基酸、至少两个氨基酸、至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸、至少十个氨基酸或多于十个氨基酸。

在某些实施方式中，接头包括亚烷基链，诸如但不限于C

核酸修饰

可以对本发明的核酸分子进行修饰以提高在血清或用于细胞培养的生长培养基中的稳定性。为了增强稳定性，可以稳定3’-残基以防降解，如，可以选择它们，使得它们由嘌呤核苷酸组成，特别是由腺苷或鸟苷核苷酸组成。可选地，通过修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，如，由2’-脱氧胸苷取代尿苷，是容许的(tolerated)并且不影响分子的功能。

在某些实施方式中，核酸分子可以包含至少一个修饰的核苷酸类似物。例如，端部可以通过并入修饰的核苷酸类似物进行稳定化。

核苷酸类似物的非限制性实例包括糖-和/或主链-修饰的核糖核苷酸(即包括对磷酸-糖主链的修饰)。例如，天然RNA的磷酸二酯键可以被修饰以包括氮或硫杂原子中的至少一个。在某些主链-修饰的核糖核苷酸中，连接至相邻核糖核苷酸的磷酸酯基团被如硫代磷酸酯基团的修饰基团置换。在某些糖-修饰的核糖核苷酸中，2’OH-基团被选自H、OR、R、卤基、SH、SR、NH

修饰的其他实例是核碱基-修饰的核糖核苷酸，即核糖核苷酸——其包含至少一个非天然存在的核碱基代替天然存在的核碱基。可以修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。示例性修饰的核碱基包括但不限于在5-位修饰的尿苷和/或胞苷，如，5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位修饰的腺苷和/或鸟苷，如，8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，如，7-脱氮-腺苷；O-和N-烷基化的核苷酸，如，N

可以添加修饰以增强稳定性、功能性和/或特异性，并使本发明的短发夹核酸分子的免疫刺激特性最小化。例如，突出端可以是未修饰的，或者可以包含一种或多种特异性或稳定化修饰，诸如，2’-位的卤素或O-烷基修饰；或核苷酸间修饰，诸如硫代磷酸酯修饰。突出端可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸或核糖核酸和脱氧核糖核酸的组合。

在一些情况下，核酸分子包含以下化学修饰中的至少一种：一种或多种核苷酸的2’-H、2’-O-甲基或2’-OH修饰；主链的一种或多种硫代磷酸酯修饰；和非核苷酸部分；其中，与对应的不具有化学修饰的短发夹核酸分子相比，至少一个化学修饰赋予降低的免疫刺激活性、增加的血清稳定性或两者。

在某些实施方式中，嘧啶核苷酸包括2’-O-甲基嘧啶核苷酸和/或2’-脱氧-嘧啶核苷酸。

在某些实施方式中，一些或全部嘌呤核苷酸可以包括2’-O-甲基嘌呤核苷酸和/或2’-脱氧-嘌呤核苷酸。

在某些实施方式中，化学修饰存在于靠近本发明的核酸分子的3’和/或5’-端的核苷酸中。

在某些实施方式中，本发明的核酸分子可以对核酸酶具有增强的抗性。对于增加的核酸酶抗性，核酸分子可以包括例如，2’-修饰的核糖单元和/或硫代磷酸酯键。例如，2’-羟基(OH)可以被多个不同的“氧基”或“脱氧”取代基诸如但不限于2’-脱氧-2’-氟衍生物(其中羟基被氟原子置换)修饰或置换。

对于增加的核酸酶抗性，本发明的核酸分子可以包括2’-O-甲基、2’-氟、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-氨基丙基、2’-氨基和/或硫代磷酸酯键。包括LNA修饰、亚乙基核酸(ENA)修饰(如2’-4’-亚乙基-桥连核酸)和某些核碱基修饰诸如2-氨基-A、2-硫代(如，2-硫代-U)、G-钳修饰(G-clamp modification)，也可以增加对靶的结合亲和力。

在某些实施方式中，核酸分子包括2’-修饰的核苷酸，如，2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)。在某些实施方式中，核酸分子包括至少一个2’-O-甲基-修饰的核苷酸，和在一些实施方式中，核酸分子的所有核苷酸都包括2’-O-甲基修饰。

“氧基”-2’-羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH

“脱氧”修饰包括氢(即，脱氧核糖)；卤基(如，氟)；氨基(如，NH

示例性取代基包括2’-甲氧基乙基、2’-OCH

增加抗性的一个方式是鉴定切割位点并修饰这类位点以抑制切割。例如，二核苷酸5’-UA-3’、5’-UG-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’或5’-CC-3’可以作为切割位点。因此，增强的核酸酶抗性可以通过修饰5’-核苷酸来实现，例如产生至少一个5’-尿苷-腺嘌呤-3’(5’-UA-3’)二核苷酸，其中尿苷是2’-修饰的核苷酸；至少一个5’-尿苷-鸟嘌呤-3’(5’-UG-3’)二核苷酸，其中5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸；至少一个5’-胞苷-腺嘌呤-3’(5’-CA-3’)二核苷酸，其中5’-胞苷是2’-修饰的核苷酸；至少一个5’-尿苷-尿苷-3’(5’-UU-3’)二核苷酸，其中5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸；或至少一个5’-胞苷-胞苷-3’(5’-CC-3’)二核苷酸，其中5’-胞苷是2’-修饰的核苷酸。寡核苷酸分子可以包括这类二核苷酸中的至少2个、至少3个、至少4个或至少5个。在某些实施方式中，核酸分子的所有嘧啶携带2’-修饰，并且因此核酸分子对核酸内切酶具有增强的抗性。在某些实施方式中，核酸分子的所有嘌呤携带2’-修饰，并且因此核酸分子对核酸内切酶具有增强的抗性。在某些实施方式中，核酸分子的至少一个嘧啶携带2’-修饰，并且因此核酸分子对核酸内切酶具有增强的抗性。在某些实施方式中，核酸分子的至少一个嘌呤携带2’-修饰，并且因此核酸分子对核酸内切酶具有增强的抗性。

关于硫代磷酸酯键，其用于增加对RNA酶活性的保护，核酸分子可以在核苷酸序列的5’-或3’-端处的至少第一、第二或第三核苷酸间键中包括硫代磷酸酯。为了最大化核酸酶抗性，2’-修饰可以与一个或多个磷酸接头修饰(如，硫代磷酸酯)联合使用。

在某些实施方式中，在核酸主链中包括吡喃糖还可以降低内核分离。在某些实施方式中，在核酸主链中包括呋喃糖还可以降低内核分离。

在某些实施方式中，5’-末端可以被氨基烷基基团封闭(阻断，block)，如，5’-O-烷基氨基取代基。其他5’-缀合物可以抑制5’至3’-核酸外切裂解。尽管不受理论的约束，5’-缀合物可以通过空间阻断核酸外切酶结合至寡核苷酸的5’-端来抑制核酸外切裂解。即使小的烷基链、芳基基团、或杂环缀合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)可以阻断5’-3-核酸外切酶。

因此，核酸分子可以包括修饰以便抑制例如通过在受试者体内发现的核酸酶，如核酸内切酶或核酸外切酶的降解。这些单体在本文中称为NRM或核酸酶抗性促进单体，相应的修饰为NRM修饰。在许多情况下，这些修饰也将调节寡核苷酸分子的其他特性，如与蛋白质(如转运蛋白，如血清白蛋白)相互作用的能力。

可以将一种或多种不同的NRM修饰引入核酸分子或核酸分子序列中。NRM修饰可以在序列或核酸分子中使用超过一次。

NRM修饰包括可仅位于末端的一些修饰以及可以在任何位置进行的其他修饰。可以抑制杂交的一些NRM修饰优选仅在末端区使用，且更优选不在核酸分子的切割位点处或切割区中使用。

这样的修饰可以被引入靶向的序列或不靶向受试者中序列的序列的末端区，如，末端位置或末端的2-、3-、4-或5-位置。

在某些实施方式中，核酸分子包括改善靶向的修饰，如，本文描述的靶向修饰。将核酸分子靶向特定细胞类型的修饰实例包括碳水化合物糖，诸如半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖；维生素，诸如叶酸；其他配体，诸如RGD和RGD模拟物；以及小分子，包括萘普生、布洛芬或其他已知的蛋白结合分子。

可以使用本领域已知的方法，使用化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸分子。例如，可以使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子的生物稳定性或增加核酸分子和靶(如，硫代磷酸酯衍生物)之间结合的物理稳定性的各种修饰的核苷酸来化学合成核酸分子，且可以使用吖啶取代的核苷酸。本文描述了其他适当的核酸修饰。可选地，可以使用表达载体生物学地产生核酸分子。

为了易于说明，术语核苷酸或核糖核苷酸有时在本文中用于指代寡核苷酸试剂的一个或多个单体亚基。在本文中应理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”的使用在修饰的RNA或核苷酸替代物的情况下，还指一个或多个位置处的修饰的核苷酸或替代物置换部分。

在某些实施方式中，本发明的核酸分子优选具有以下性质中的一个或多个：

(1)5’-修饰，其包括一个或多个磷酸基团或磷酸基团的一个或多个类似物；

(2)尽管修饰，但甚至是非常大量的碱基明确地碱基配对并形成具有双链区的双链体结构；

(3)尽管修饰，但甚至是非常大量的或全部核苷仍具有“RNA-样”性质，即，其将具有RNA分子的整体结构、化学和物理性质，即使不是排他性地或甚至部分地是基于核糖核苷酸含量。例如,全部核苷酸糖可以包含如，2’-OMe、2’-氟代替2’-羟基。该含脱氧核糖核苷酸的试剂可以仍然被预期展现RNA-样性质。尽管不希望受理论的限制，但当附接至核糖的C2’位置时，电负性氟优选轴向取向。氟的这种空间偏好可又迫使糖采用C

具有C3’-内糖褶皱的2’-修饰包括2’-OH、2’-O-Me、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-氨基丙基、2’-F、2’-O-CH

具有C2’-内糖褶皱的2’-修饰包括2’-H、2’-Me、2’-S-Me、2’-乙炔基和2’-ara-F。

糖修饰还可以包括L-糖和2’-5’-连接的糖。

本文讨论的核酸试剂包括另外未修饰的RNA和DNA以及经过修饰(如，以提高功效)的RNA和DNA和核苷替代物的聚合物。未修饰的RNA是指其中核酸成分(即糖、碱基和磷酸部分)与自然界中的，优选人体中天然存在的，相同或基本相同的分子。本领域将稀有或不寻常但天然存在的RNA称为修饰的RNA，请参见，如，Limbach et al.,Nucleic AcidsRes.1994,22:2183-2196。这种稀有或不寻常的RNA(通常被称为修饰的RNA)通常是转录后修饰的结果，并且在本文所用的术语未修饰的RNA之内。本文所用的修饰的RNA是指其中核酸中的一种或多种成分(即糖、碱基和磷酸基团)与自然界中存在的那些，优选人体中天然存在的那些不同。虽然它们被称为“修饰的RNA”，但是它们将当然，由于修饰，严格来说，包括不是RNA的分子。核苷替代物是其中核糖磷酸主链被非核糖磷酸构建体替换的分子，该构建体使碱基以正确的空间关系呈现，使得杂交基本上类似于核糖磷酸主链所见，如，核糖磷酸主链的不带电模拟物。本文讨论了所有本文考虑的实例。

由于核酸是亚基或单体的聚合物，因此本文其他各处所述的许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如，碱基或磷酸部分，或磷酸部分的非连接O的修饰。在一些情况下，修饰将发生在核酸的所有受试位置(subject position)上，但是在许多情况下，实际上在大多数情况下其不会进行。例如，修饰可以仅发生3’-或5’-末端位置处、在末端区中，如，在末端核苷酸上的位置处或链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。配体可以附接在3’-端、5’-端、或在内部位置处，或这些位置的组合处。例如，配体可以在3’-端和5’-端；在3’-端和在一个或多个内部位置处；在5’-端和在一个或多个内部位置处；或在3’-端、5’-端和在一个或多个内部位置处。例如，在非连接O位置处的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端处，或可以仅发生在末端区中，如在末端核苷酸上的位置处或核酸的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。5’-端可以被磷酸化。

本文其他地方讨论了修饰和核苷酸替代物。

式1中呈现的支架代表了部分核糖核酸。基本成分是核糖、碱基、末端磷酸和磷酸核苷酸间接头。当碱基是天然存在的碱基，如，腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶，糖是未修饰的2’羟基核糖(如所描绘的)，和W、X、Y、和Z全部是O时，式1代表了天然存在的未修饰的寡核糖核苷酸。

未修饰的寡核糖核苷酸在一些应用中可能不是最佳的，如，未修饰的寡核糖核苷酸可以容易被如细胞核酸酶降解。核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。然而，对RNA成分中一个或多个的化学修饰可以赋予提高的性质，并且例如可以使寡核糖核苷酸对核酸酶更加稳定。未修饰的寡核糖核苷酸在提供用于将配体或其他部分附接至核酸试剂的束缚点方面，也可能不是最佳的。

修饰的核酸和核苷酸替代物可以包括以下中的一个或多个：

(i)改变(变更，alteration)，如，非连接(X和Y)磷酸氧中的一个或两个和/或连接(W和Z)磷酸氧中的一个或两个的置换。当磷酸处于末端位置时，位置W或Z中一个不会将磷酸连接至天然存在的核糖核酸中的另外的元件。然而，为了简化术语，除非另有说明，否则核酸的5’端的W位置和核酸的3’端的末端Z位置在本文所用的术语“连接磷酸氧”内；

(ii)改变，如，核糖的组成的置换，如核糖上2’羟基的置换，或用除核糖外的结构大规模置换核糖，如本文所描述；

(iii)用“脱磷”接头大规模置换磷酸部分(括号I)；

(iv)天然存在的碱基的修饰或置换；

(v)核糖-磷酸主链(括号II)的置换或修饰；

(vi)RNA的3’-端或5’-端的修饰，如，末端磷酸基团的去除、修饰或置换，或部分(诸如荧光标记的部分)与RNA3’-或5’-端的缀合。

在上下文中所使用的术语置换、修饰、改变等并不暗示任何方法限制，如，修饰并不意味着必须以参考或天然存在的核糖核酸开始，并对其进行修饰以产生修饰的核糖核酸，而是修饰的仅仅表明与天然存在分子存在差异。

应答理解，某些化学实体的实际电子结构不能仅用一种规范形式(即路易斯结构)来充分表示。尽管不希望受理论束缚，但实际结构可以是一些杂交物或两个或多个的规范形式的加权平均值，统称为共振形式或结构。共振结构不是离散的化学实体，且仅存在于纸面上。它们之间的区别仅在于特定化学实体的键合和非键合电子的放置或“定域”。一种共振结构可能比其他共振结构更大程度地促成杂交物。因此，本发明的实施方式的书面和图形描述是根据本领域公认的具体种类的主要共振形式来进行的。例如，任何氨基磷酸酯(用氮置换非连接氧)将由式1中的X＝O和Y＝N代表。

磷酸基团

磷酸基团是带负电荷的物质。电荷相等地分布在两个非连接氧原子上(即式1中的X和Y)。但是，磷酸基团可以通过用不同的取代基置换氧原子中的至少一个进行修饰。对RNA磷酸主链的该修饰的一个结果可以是寡核糖核苷酸对溶核分解的抗性增加。因此，尽管不希望受到理论的束缚，但在一些实施方式中，可能希望引入导致不带电荷的接头或具有不对称电荷分布的带电接头的改变。

修饰的磷酸基团的实例包括硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯(phosphoroselenate)、硼酸磷酸(borano phosphates)、硼酸磷酸酯(borano phosphate esters)、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有两个被硫置换的非连接氧。与其中X或Y中仅一个被改变的情况不同，二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，其排除了寡核糖核苷酸非对映异构体的形成。非对映异构体形成可能导致个体非对映异构体对核酸酶表现出不同抗性的制剂。此外，含手性磷酸基团的RNA的杂交亲和力相对于相应的未修饰RNA种类可能较低。因此，尽管不希望被理论所束缚，但对X和Y两者的修饰(其消除了手性中心，例如，二硫代磷酸酯形成)可能是期望的，因为它们不能产生非对映异构体混合物。因此，X可以是S、Se、B、C、H、N或OR(R是烷基或芳基)中的任一个。因此，Y可以是S、Se、B、C、H、N或OR(R是烷基或芳基)中的任一个。X和/或Y被硫置换是可能。

磷酸接头还可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)置换连接氧(即，式1中的W或Z)进行修饰。置换可以发生在末端氧(位置W(3’)或位置Z(5’))处。W被碳或Z被氮置换是可能。

糖基团

修饰的RNA可以包括核糖核酸的全部或一些糖基团。例如，2’-羟基(OH)可以被众多不同的“氧基”或“脱氧”取代基修饰或置换。尽管不受理论的约束，但由于羟基不在被去质子化以形成2’-醇盐离子，所以预期稳定性增强。2’醇盐可以通过对接头磷原子的分子内亲核攻击催化降解。尽管不希望受理论的约束，但是可以期望一些实施方式引入改变，其中在2’-位置处醇盐形成是不可能的。

“氧基”-2’-羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH

“脱氧”修饰包括氢(即，脱氧核糖)；卤基(如，氟)；氨基(如，NH

糖基团还可以包括具有与核糖中对应碳的立体化学构型相反的立体化学构型的一个或多个碳。因此，修饰的RNA可以包括如此核苷酸，其含有如阿拉伯糖，作为糖。

修饰的RNA还可以包括“无碱基”糖，其在C-1’处缺少核碱基。这些无碱基糖还可以在组成糖原子中的一个或多个处包含修饰。

为了最大化核酸酶抗性，2’修饰可以与一个或多个磷酸接头修饰(如，硫代磷酸酯)组合使用。所谓“嵌合”寡核苷酸是包含两个或更多个不同修饰的那些。

修饰还可以引起在核酸试剂中的一个或多个位点用另一种实体(SRMS)大规模置换核糖结构。

磷酸基团的置换

磷酸基团可以被含非磷的连接体置换(参见式1中的括号I)。尽管不希望受理论的束缚，但是据信由于带电的磷酸二酯基团是溶核降解的反应中心，所以其被中性结构模拟物置换应当赋予增强的核酸酶稳定性。再次，尽管不希望受理论的束缚，但在一些实施方式中，可以期望引入改变，其中带电的磷酸基团被中性部分置换。

可以置换磷酸基团的部分的实例包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛(thioformacetal)、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基联亚氨基、亚甲基二甲基联亚氨基和亚甲基氧甲基亚氨基。示例性置换包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基基团。

核糖磷酸主链的置换

也可以构建寡核苷酸-模拟支架，其中磷酸接头和核糖被核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置换(参见式1的括号II)。尽管不希望受到理论的束缚，但据信缺乏重复带电的主链会减少与识别聚阴离子(如核酸酶)的蛋白质的结合。再次，尽管不希望受到理论的束缚，但在某些实施方式中，可能期望引入改变，其中碱基被中性替代主链束缚。

实例包括吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。非限制性替代物是PNA替代物。

末端修饰

寡核苷酸的3’-和5’-端可以被修饰。这类修饰可以在分子的3’-端、5’-端或两端处。它们可以包括对整个末端磷酸的或磷酸基团的原子中的一个或多个的修饰或置换。例如，寡核苷酸的3’-和5’-端可以被缀合至其他官能分子实体，诸如标记部分，如荧光团(如，芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基团(如，基于硫、硅、硼或醚)。官能分子实体可以通过磷酸基团和/或间隔区被附接至糖。间隔区的末端原子可以连接至或置换磷酸基团的连接原子或糖的C-3’-或C-5’-O、N、S或C基团。可选地，间隔区可以连接至或置换核苷酸替代物(如，PNA)的末端原子。这些间隔区或接头可以包括如-(CH

可以出于多种原因添加末端修饰，包括如本文其他地方所讨论的，以调节活性和/或调节对降解的抗性和/或增强细胞摄取。非限制性修饰包括在3’-最末端键处添加甲基膦酸酯；3’-C5-氨基烷基-dT；3’-阳离子基团；或另一个3’-缀合物，以抑制3’-5’-核酸外切降解。

可用于调节活性的末端修饰包括利用磷酸或磷酸类似物的5’-端的修饰。例如，在某些实施方式中，寡核苷酸试剂在5’-末端被5’-磷酸化或包括磷酰基类似物。合适的修饰包括：5’-单磷酸酯((HO)

末端修饰也可用于监测分布，且在这种情况下，待添加的示例性基团包括荧光团如荧光素或Alexa染料如Alexa 488。末端修饰还可用于增强摄取，对此有用的修饰包括胆固醇。末端修饰还可以用于将拮抗物(antagomir)交联至另一部分；对此有用的修饰包括丝裂霉素C。

碱基

腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是RNA中发现的最常见的碱基。这些碱基可以被修饰或置换以提供具有改善性质的RNA。例如，核酸酶抗性寡核糖核苷酸可以利用这碱基或利用合成和天然核碱基(如，肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、次黄苷(nubularine)、异鸟苷(isoguanisine)或杀结核菌素(tubercidine))和本文考虑的修饰中的任一种制备。可选地，可以采用本文考虑的任意碱基的取代或修饰的类似物，如本文描述的“不寻常的碱基”和“通用的碱基”。实例包括但不限于2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，5-卤基尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，5-卤基尿嘧啶，5-(2-氨基丙基)尿嘧啶，5-氨基烯丙基尿嘧啶，8-卤基、氨基、硫醇、硫代烷基、羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤)，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶，二氢尿嘧啶，3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶，2-氨基嘌呤，5-烷基尿嘧啶，7-烷基鸟嘌呤，5-烷基胞嘧啶，7-脱氮腺嘌呤，N

方法

本发明提供了治疗或预防有需要的受试者中癌症的方法。在某些实施方式中，受试者需要此类治疗和/或预防。在某些实施方式中，方法包括向受试者施用治疗有效量的RIG-I激动剂。在某些实施方式中，方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的PD-1/PD-L1阻断剂和/或CTL4阻断剂。

本发明包括向受试者引入核酸、载体和宿主细胞的方法。引入核酸的物理方法包括注射含有核酸分子的溶液，用核酸分子覆盖的粒子进行轰击，将细胞或生物体浸入核酸分子的溶液，或在核酸分子存在的情况下对细胞膜进行电穿孔。包装到病毒颗粒中的病毒构建体将既可以实现表达构建体进入细胞的有效引入，又可以实现表达构建体编码的RNA的转录。可以使用本领域已知的将核酸引入细胞的其他方法，诸如脂质介导的载体转运，化学介导的转运，诸如磷酸钙等。因此，可以将核酸与执行以下一种或多种活性的组分一起引入核酸：增强细胞对核酸的摄取、稳定双链体或以其他方式增加核酸分子的活性。

将核酸引入细胞的方法是本领域已知的。本发明的核酸分子可以通过本领域的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，核酸分子可以通过物理、化学或生物学手段被转移到宿主细胞中。

将核酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)。

将核酸引入宿主细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，和尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物如人类细胞的最常用的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

将核酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统——包括水包油乳液、微团、混合微团和脂质体。在体内和体外用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在某些例子中，核酸经由聚合物递送载体递送。例如，核酸分子可以与基于聚合物的微团、胶囊、微粒、纳米粒子等复合。然后，可以使复合物在体内、体外或离体与细胞接触，由此将核酸分子引入细胞。示例性聚合物递送系统是本领域公知的(参见例如美国专利号6,013,240)。聚合物递送试剂是市售的，包括可从Polyplus-transfection Inc(New York,NY)获得的示例性试剂。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的含水内部中，散布在脂质体的脂双层内，通过与脂质体和寡核苷酸都缔合的连接分子附接至脂质体，捕获在脂质体内，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在或与微团复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，作为微团，或具有“坍缩”结构。它们还可以简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是可以为天然存在的或合成的脂质的脂肪物质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂滴以及包含长链脂族烃及其衍生物(诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的一类化合物。

可以从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Chol”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)以及其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是涵盖通过产生闭合的脂双层或聚集体形成的多种单和多层脂质载体的一般术语。脂质体可以表征为具有囊泡结构，其具有磷脂双层膜和内部含水介质。多层脂质体具有被含水介质分开的多个脂质层。当将磷脂悬浮在过量含水溶液中时，它们自发形成。在形成封闭结构之前，脂质成分经历自重排并在脂双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh et al.,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖了在溶液中具有与正常囊泡不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现微团结构或仅仅作为脂质分子的非均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。

无论采用何种方法将核酸分子引入宿主细胞或以他方式使细胞暴露于本发明的分子，为了确认宿主细胞中核酸的存在，都可以进行各种测定。例如，本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR。

本发明的核酸分子可以直接引入细胞(即细胞内)；或细胞外引入腔——间质空间、进入生物体循环、口服引入，或者可以通过将细胞或生物体浸入含有核酸分子的溶液引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液是可以引入核酸分子的部位。

可选地，载体，如，编码本发明的核酸分子的转基因可以使用本领域公认的技术被工程化到宿主细胞内或转基因动物中。

本发明提供诱导细胞中IFN应答的方法。例如，在某些实施方式中，方法诱导I型IFN应答。I型IFN包括，例如，IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ。本申请还提供至少一种核酸分子用于体外诱导肿瘤细胞凋亡的用途。

本发明提供了在细胞中刺激IFN应答(包括例如I型IFN应答)的体外方法，该方法包括使细胞与本发明的至少一种核酸分子接触。

细胞可以内源地和/或外源地从外源核酸(RNA或DNA)表达PRR。外源DNA可以是质粒DNA、病毒载体或其部分。外源DNA可以整合到细胞基因组中或可以染色体外存在。细胞包括但不限于原代免疫细胞、原代非免疫细胞和细胞系。免疫细胞包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)、浆细胞样树突细胞(PDC)、髓样树突细胞(MDC)、巨噬细胞、单核细胞、B细胞、自然杀伤细胞、粒细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NKT细胞。非免疫细胞包括但不限于成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和肿瘤细胞。细胞系可以源自免疫细胞或非免疫细胞。

本发明提供了诱导肿瘤细胞凋亡和/或死亡的体外方法，该方法包括使肿瘤细胞与本发明的至少一种核酸分子接触。肿瘤细胞可以是从患有肿瘤的脊椎动物中新鲜分离的原代肿瘤细胞或肿瘤细胞系。

在某些实施方式中，本发明提供了用于诱导患者的IFN应答的预防性和治疗性方法。应理解，本文所用的“治疗”或“处理”定义为向患者应用或施用治疗剂(如，核酸分子)，或向来自患有疾病或紊乱、具有疾病或紊乱的症状或易患疾病或紊乱的患者的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，其目的为治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病或紊乱，疾病或紊乱的症状或易患疾病的倾向。

在某些实施方式中，本申请提供本发明的核酸分子的体内用途。在某些实施方式中，本申请提供本发明的至少一种核酸分子，用于诱导脊椎动物中特别是哺乳动物中的IFN应答(包括例如I型IFN应答)。本申请进一步提供本发明的至少一种核酸分子，用于诱导脊椎动物中特别是哺乳动物中肿瘤细胞的凋亡。本申请另外地提供本发明的至少一种核酸分子，用于预防和/或治疗脊椎动物中特别是哺乳动物中在医学和/或兽医学实践中的疾病和/或紊乱。本发明还提供本发明的至少一种核酸分子，用作疫苗佐剂。

此外，本申请提供本发明的至少一种核酸分子在制备用于诱导脊椎动物中特别是哺乳动物中的IFN应答(包括例如I型IFN应答)的药物组合物中的用途。本申请进一步提供本发明的至少一种核酸分子在制备用于诱导脊椎动物中特别是哺乳动物中肿瘤细胞的凋亡和/或死亡的药物组合物中的用途。本申请另外地提供本发明的核酸分子在制备用于预防和/或治疗脊椎动物中特别是哺乳动物中在医学和/或兽医学实践中的疾病和/或紊乱的药物组合物中的用途。

本发明涵盖核酸分子预防和/或治疗其中诱导IFN产生将是有益的任何疾病、紊乱或病症的用途。例如，通过本发明的核酸分子增加IFN产生可以对预防或治疗多种紊乱是有益的，其包括但不限于癌症等。

肿瘤包括良性和恶性肿瘤(即，癌症)。癌症包括但不限于胆道癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、上皮内肿瘤、白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌和肾癌。

在某些实施方式中，癌症选自毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病、皮肤T-细胞白血病、慢性髓样白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌、基底细胞癌(basaliom)、结肠癌、宫颈发育不良和卡珀斯肉瘤(AIDS-相关的和非-AIDS相关的)。

在某些实施方式中，本发明的核酸分子与一种或多种药物活性剂联合使用，诸如免疫刺激剂、抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗肿瘤剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、抗血管生成因子、化学治疗剂、抗体和基因沉默剂。优选地，药物活性剂选自免疫刺激剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗炎剂和抗氧化剂。一种以上的药物活性剂可以是相同或不同的类别。

在某些实施方式中，本发明的核酸分子与抗原和/或抗肿瘤疫苗联合使用，其中疫苗可以是预防性的和/或治疗性的。核酸分子可以用作佐剂。

在另一实施方式中，核酸与视黄酸(retinoic acid)和/或I型IFN(IFN-α和/或IFN-β)联合使用。不受任何理论的束缚，视黄酸(retinoid acid)、IFN-α和/或IFN-β能够使细胞对IFN-β敏化，这可能通过上调PRR表达。

在某些实施方式中，本发明的核酸用于与疾病和/或紊乱(诸如肿瘤)的一种或多种预防性和/或治疗性治疗联合使用。治疗可以是药理的和/或物理的(如，手术、放射)。

脊椎动物包括但不限于鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物。哺乳动物包括但不限于大鼠、小鼠、猫、狗、马、绵羊、牛、奶牛、猪、兔、非人灵长类和人。在示例性实施方式中，哺乳动物是人。

施用/给药

施用方案可以影响构成的有效量。可以在诊断疾病之前或之后向受试者施用治疗制剂。此外，可以每天或相继施用数个分开的剂量以及交错剂量，或者药剂可以连续输注，或者可以弹丸注射。此外，治疗制剂的剂量可以根据治疗或预防情况的紧急程度所指示成比例地增加或减少。

可以使用已知方法，以有效预防或治疗疾病的剂量和时间段，将本发明的组合物施用至受试者，优选哺乳动物，更优选人类。实现治疗效果所需的有效量的治疗化合物可能会因多种因素而异，诸如所用具体化合物的活性；施用时间；化合物的排泄速率；治疗持续时间；与该化合物联合使用的其他药物、化合物或材料；正治疗的受试者的疾病或紊乱的状态、年龄、性别、体重、状况、一般健康情况以及既往病史；以及医学领域众所周知的类似因素。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，可以每天施用可以数个分开的药剂，或者可以根据治疗情况的紧急程度所指示成比例地减少药剂。本发明的治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例是每天约1至5,000mg/kg体重。本领域的普通技术人员将能够研究相关因素并确定治疗化合物的有效量而无需过多的实验。

化合物可以每天多次频繁地施用于受试者，或者可以较不频繁地施用，诸如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更少频率，诸如每数月一次，或甚至每年一次，或更少。可以理解，在非限制性实例中，每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天，可以施用每天给药的化合物的量。例如，利用每隔一天施用，可以在星期一开始5mg/天的剂量，随后的第一个5mg/天的剂量在周三施用，随后的第二个5mg/天的剂量在周五施用，依此类推。给药的频率对本领域技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，诸如但不限于正治疗的疾病的类型和严重性、动物的类型和年龄等。

可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得对于具体受试者、组合物和施用方式实现期望治疗应答有效，而对受试者无毒的活性成分的量。

具有本领域普通技术的医生，如，医师或兽医，可以容易地确定并开出所需的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于为了实现期望的治疗效果所需要的水平开始药物组合物中采用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量直到实现期望的效果。

在具体实施方式中，尤其有利的是以单位剂型配制化合物，便于剂量的施用和均匀。本文所使用的单位剂型是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每单位包含计算为与需要的药物载体缔合产生期望治疗效果的预定数量的治疗化合物。本发明的单位剂型由以下规定并直接依赖其：(a)治疗化合物的独特特性和待实现的具体治疗效果，和(b)在配制/调配用于治疗受试者中疾病的这类治疗化合物的领域中固有的局限性。

施用的本发明化合物的范围可以为约1mg至约10,000mg、约20mg至约9,500mg、约40mg至约9,000mg、约75mg至约8,500mg、约150mg至约7,500mg、约200mg至约7,000mg、约3050mg至约6,000mg、约500mg至约5,000mg、约750mg至约4,000mg、约1mg至约3,000mg、约10mg至约2,500mg、约20mg至约2,000mg、约25mg至约1,500mg、约50mg至约1,000mg、约75mg至约900mg、约100mg至约800mg、约250mg至约750mg、约300mg至约600mg、约400mg至约500mg，以及其之间的任何和全部整个或部分增量。

在一些实施方式中，本发明化合物的剂量是从约1mg和约2,500mg。在一些实施方式中，本文描述的组合物中使用的本发明化合物的剂量小于约10,000mg、或小于约8,000mg、或小于约6,000mg、或小于约5,000mg、或小于约3,000mg、或小于约2,000mg、或小于约1,000mg、或小于约500mg、或小于约200mg、或小于约50mg。类似地，在一些实施方式中，本文描述的第二化合物(即，用于治疗与由本发明的组合物所治疗的疾病相同的疾病或另一疾病的药物)的剂量小于约1,000mg、或小于约800mg、或小于约600mg、或小于约500mg、或小于约400mg、或小于约300mg、或小于约200mg、或小于约100mg、或小于约50mg、或小于约40mg、或小于约30mg、或小于约25mg、或小于约20mg、或小于约15mg、或小于约10mg、或小于约5mg、或小于约2mg、或小于约1mg、或小于约0.5mg，以及其任何和全部整个或部分增量。

在某些实施方式中，本发明涉及包装的药物组合物，其包括容纳单独的或联合第二药剂的治疗有效量的本发明的化合物或缀合物的容器；和使用化合物或缀合物治疗、预防或减轻受试者中疾病的一个或多个症状的说明书。

术语“容器”包括用于容纳药物组合物的任何受器(receptacle)。例如，在某些实施方式中，容器是含有药物组合物的包装。在其他实施方式中，容器不是含有药物组合物的包装，即容器是受器，诸如，含有包装的药物组合物或未包装的药物组合物以及药物组合物的使用说明书的盒子或小瓶。此外，包装技术在本领域中是众所周知的。应该理解，药物组合物的使用说明书可以包含在含有药物组合物的包装上，并因此说明书形成与包装的产品的增加的功能关系。但是，应该理解，说明书可能包含有关化合物执行其预期功能的能力的信息，如，治疗或预防受试者的疾病，或向受试者递送成像或诊断剂。

药物组合物

本发明提供了包含至少一种本发明的核酸分子和药学上可接受的载体的药物组合物。本文描述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常地，这类制备方法包括以下步骤：将活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分缔合在一起，然后如果需要或希望将产品成形或包装为期望的单剂量或多剂量单位。

尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人类进行伦理施用的药物组合物，但本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于对所有分类的动物给药。修改适合于向人类施用的药物组合物从而使组合物适合于向各种动物施用是众所周知的，并且普通熟练的兽医药理学家可以仅通过普通的实验(如果有的话)就可以设计和进行这种修改。考虑施用本发明药物组合物的受试者包括但不限于人类和其他灵长类动物、哺乳动物，其包括商业有关的哺乳动物，诸如非人灵长类动物、牛、猪、马、绵羊、猫和狗。

可用于本发明方法的药物组合物可以以适合眼科、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、颊或另一施用途径的制剂制备、包装或出售。其他考虑的制剂包括预计的纳米颗粒、脂质体制品、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的制剂。

本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量散装制备、包装或销售。如本文所用，“单位剂量”是离散量的包含预定量的活性成分的药物组合物。活性成分的量通常等于将被施用于受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便的分数，诸如，例如，该剂量的二分之一或三分之一。

本发明药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何另外成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、大小和状况以及进一步根据施用组合物的途径而改变。例如，组合物可包含0.1％和100％(w/w)之间的活性成分。

除活性成分外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种另外的药物活性剂。可用于本发明的其他活性剂包括抗炎药——其包括皮质类固醇和免疫抑制剂、化学治疗剂、抗生素、抗病毒药、抗真菌药等。

本发明药物组合物的控释或缓释制剂可以使用常规技术制备，例如使用装备有pH敏感结构域或蛋白酶可裂解片段的蛋白质。在一些情况下，可以提供待使用的剂型为慢释或控释其中的一种或多种活性成分，其例如使用氢丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、透性膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体或微球或其组合来提供变化比例的期望释放曲线。本领域普通技术人员已知的合适的控释制剂——包括本文所述的那些，可以被容易地选择以与本发明的药物组合物一起使用。因此，本发明涵盖了适合于口服施用的单一单位剂型，诸如片剂、胶囊剂、软胶囊(gel-caps)和囊片，其适合控释。

在某些实施方式中，本发明的制剂可以是但不限于短期、快速抵消(rapid-offset)以及受控，诸如缓释、延迟释放和脉冲释放制剂。

术语缓释以其常规含义使用，是指在延长的时间段内提供药物的逐步释放的药物制剂，尽管不必需，但在延长的时间段内可导致药物的血药水平基本上恒定。时间段可以长达一个月或更长，并且应该是比以弹丸形式施用的相同量的试剂更长时间的释放。

为了缓释，可以将化合物与为化合物提供缓释特性的合适聚合物或疏水材料一起配制。因此，本发明的方法使用的化合物可以以微粒形式施用，例如通过注射或以晶片或光盘形式植入。

在本发明的示例性实施方式中，使用缓释制剂将本发明的化合物单独或与另一种药剂组合施用给受试者。

术语延迟释放在本文中以其常规含义使用，是指在药物施用后的一些延迟后提供药物的初始释放的药物制剂，并且尽管不必需，但该药物制剂可包括从约10分钟上至约12小时的延迟。

术语脉冲释放在本文中以其常规含义使用，是指以药物施用后产生药物的脉冲血浆曲线的方式提供药物释放的药物制剂。

术语立即释放以其常规含义使用，是指在药物施用后立刻提供药物释放的药物制剂。

如本文所使用，短期是指在药物施用后，上至并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟以及药物施用后其任意或全部整个或部分增量的任何时间段。

如本文所使用，快速抵消是指在药物施用后，上至并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟以及其任意或全部整个或部分增量的任何时间段。

如本文所使用，“另外的成分”包括但不限于以下一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理上可降解的组合物，诸如明胶；水性载体和溶剂；油性载体和溶剂；悬浮剂；分散或湿润剂；乳化剂、粘滑剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合或疏水材料。可以包括在本发明的药物组合物中的其他“另外的成分”是本领域内已知的并且例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1985,Genaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA)中进行描述，其通过引用并入本文。

本发明的任何组合物的施用途径包括口服、鼻、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(如，舌下、舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(如，经和阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。

合适的组合物和剂型包括，例如，片剂、胶囊剂、囊片、丸剂、软胶囊、糖锭、分散剂、悬浮剂、溶液、糖浆、颗粒剂、珠、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、粒剂、乳浆剂(magmas)、锭剂、乳剂、糊剂、膏药、洗剂、盘片(disc)、栓剂、用于鼻腔或口服施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或雾化制剂、用于膀胱内施用的组合物和制剂等。可用于本发明的制剂和组合物不限于本文描述的具体制剂和组合物。

如本文所使用，药物组合物的“肠胃外给药”包括特征在于物理突破受试者的组织并通过组织中的破口施用药物组合物的任何施用途径。肠胃外施用因此包括但不限于：通过注射组合物施用药物组合物，通过外科手术切口应用组合物，通过穿透组织的非手术伤口应用组合物等。特别地，考虑肠胃外施用包括但不限于：眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射、肿瘤内和肾脏透析输注技术。

适于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体(诸如无菌水或无菌等渗盐水)结合的活性成分。此类制剂可以适于弹丸施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射制剂可以单位剂型制备、包装或出售，诸如在含有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮剂、溶液、油或含水载体中的乳液、糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。此类制剂可进一步包含一种或多种另外的成分，其包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在肠胃外施用的制剂的某些实施方式中，活性成分以干燥(即粉末或粒状)形式提供，用于使用合适的载体(如无菌无热原的水)进行重构，然后肠胃外施用重构的组合物。

试剂盒

如在本文其他地方所描述，本发明还提供了刺激PRR活性、诱导IFN应答和/或治疗癌症的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包括包含核酸分子和另一种治疗剂的组合物，如本文其他地方所描述，以及其使用说明书。说明书通常包括有关使用试剂盒中的组合物刺激PRR活性和/或治疗癌症的信息。说明书可以直接印刷在试剂盒内的容器上(当存在时)，或作为标签贴在容器上，或作为单独的纸张、小册子、卡片或文件夹供应在容器中或与容器一起供应。

本发明还提供了用于治疗或预防如此疾病、紊乱或病症的试剂盒，在疾病、紊乱或病症中IFN产生是有益的。在某些实施方式中，试剂盒包括包含核酸分子和另一种治疗剂的组合物(如药物组合物)，如本文其他地方所述，以及其使用说明书。说明书通常包括有关使用试剂盒中的组合物以治疗或预防疾病或紊乱或其症状的信息。说明书可以直接印刷在试剂盒内的容器上(当存在时)，或作为标签贴在容器上，或作为单独的纸张、小册子、卡片或文件夹供应在容器中或与容器一起供应。

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文描述的具体程序、实施方式、权利要求和实施例的许多等同形式。这些等同形式被认为在本发明的范围内，并由所附权利要求书覆盖。例如，应当理解，采用本领域公认的替代方案并且仅使用常规实验对反应和/或处理条件的修改在本申请的范围内。

实验实施例

通过参考以下实验实施例进一步详细地描述本发明。这些实施例仅出于说明的目的提供，除非另有说明，并不旨在是限制性的。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应当理解为包含通过本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。

无需进一步描述，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和以下的示例性实施例，制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。因此，以下的工作实施例具体指出了本发明的示例性实施方式，并且不应将其解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例1：体内研究

RIG-1的茎环RNA(SLR-RG)激动剂单独或与抗-PD-1组合的功效可以在皮下同基因小鼠肿瘤模型中进行测试。例如，CT-26(结肠)、RENCA(肾脏)和LL2(肺)是对抗-PD-1部分应答的癌细胞系。该研究可以使用7组动物(其中每组10只动物)：对照(同种型+载体)、抗-PD-1+载体、同种型+SLR-RG(高剂量)、抗-PD-1+SLR-RG(高剂量)、抗-PD-1+SLR-RG(中剂量)、抗-PD-1+SLR-RG(低剂量)、同种型+CpG。

可以评估在本文描述的研究中用SLR-GR进行肿瘤内治疗后通过再攻击的免疫记忆。在该情况中，可以在根除肿瘤后2-3周，用相同的肿瘤细胞系再攻击在本文所描述的研究中实现完全消退的小鼠的对侧腹。

可以在小鼠远位肿瘤模型中评估SLR-RG的功效(参见图5)。

可以在4T1自发转移肿瘤模型中评估SLR-RG的功效。该研究可以使用5组动物(其中每组16只动物)：载体(肿瘤内)、载体(静脉内)、SLR-RG(肿瘤内，有效剂量在小鼠远位肿瘤模型中确定)、SLR-RG(静脉内)和CpG(肿瘤内)。

可以在人源化NSG或人源化NOG-EXL小鼠中确定SLR-RG对比CpG的功效。例如，在该研究中可以使用Panc08.13。该研究可以使用3组动物(其中每组8只动物)：SLR-RG(肿瘤内)、CpG(肿瘤内)和载体对照。

实施例2:

图7图解了与体内研究相关的某些结果，其中B6小鼠用SLR14和抗-PD1疗法共治疗。如图所示，用SLR14和抗-PD1的组合治疗的小鼠显示了与仅用抗-PD1治疗的小鼠相比较慢的肿瘤体积。

实施例3:

研究了在SLR诱导干扰素应答的能力中碱基序列、双链区段长度(即，碱基对数目)和环同一性的作用。制备以下SLR并测试其抑制RIG-I活性的能力。图12中图解了利用选择的SLR在HEK-293T细胞中的干扰素应答。

如图12中所证明，当与对照分子(SLR-14)进行比较时，具有更短双链区段的SLR(8个碱基对；SLR-8)具有低但可检测的活性，并且当与SLR-14进行比较式，9-碱基对SLR(SLR-9)具有降低但可测量的活性。

还观察到，SLR的活性取决于双链区段中碱基的同一性和序列(参见，例如，SLR-9GC对比SLR-9，和SLR-8GC对比SLR-8)。

进一步，实验显示了环可以被无碱基核苷酸接头或非磷酸接头(诸如据乙二醇)置换，而没有显著的活性损失(参见，例如，SLR-14Ab5和SLR14S18分别对比SLR-14)。在某些实施方式中，这类接头不是核酸酶的底物，并以此在体外或体内更稳定。

实施例4:

研究了SLR诱导干扰素应答的能力中3’-突出端或5’-突出端存在的作用。如图13A-13B和14A-14D中所证明，具有任何长度的5’-突出端的SLR基本上无活性。然而，具有单个3’-突出端核苷酸残基的SLR具有活性吗，并且具有多个3’-突出核苷酸的SLR具有降低但显著水平的活性。

实施例5:

该研究涉及SLR14在不同类型的肿瘤模型中通过肿瘤内(i.t.)递送的体内抗肿瘤作用。

材料和方法

小鼠和肿瘤细胞

C57BL/6J和C57BL/6J RAG1

在该研究中使用三种小鼠肿瘤细胞系：在具有10％FBS和1％抗生素的DMEM中培养B16F10黑色素瘤细胞和MC38结肠癌细胞；而将黑色素瘤细胞系YUMMER1.7细胞(Wang,etal.,2017,Pigment Cell Melanoma Res 30(4):428-435)保持在含有10％FBS、1％非必需氨基酸和1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中。

SLR-14寡核苷酸的合成、纯化和标记

合成三磷酸化RNA寡核苷酸SLR-14(5’pppGG AUCG AUCG AUCG UUCG CGAU CGAUCGAU CC；SEQ ID NO:1)(Mihaylova,et al.,2018,Cell Rep 24(11):3000-3007.e3)，略微修改。简言之，从聚合物支持体去除寡核苷酸并且碱基脱保护在65℃下、40％甲基胺(Sigma)和30％氢氧化铵(JT Baker)的1:1混合物中进行15分钟。在冰上冷却溶液持续10分钟，将其转移至新的小瓶并蒸发至干燥。然后添加500μl的纯乙醇并再次将混合物蒸发至干燥。为了使2’-OH基团脱保护，在室温下用四氢呋喃(THF)(Sigma)中500μl的1M四丁基氟化铵(TBAF)溶液温育干燥寡核苷酸持续36h。然后添加500μl的2M乙酸钠(pH6.0)，将溶液蒸发至500-600μl体积，用3×800μl的乙酸乙酯萃取并进行乙醇沉淀。然后在16％变性聚丙烯酰胺凝胶上纯化RNA寡核苷酸。本领域技术人员已经考虑制备磷酸化寡核苷酸的任何已知方法将在本发明内是有用的。

将纯化的SLR-14寡核苷酸溶解在200μl的0.25M碳酸氢钠缓冲液(pH 9.2)中。然后，添加含有200μl甲酰胺中0.5mg的Alexa Fluor 647NHS酯(Life Technologies Corp.)的溶液，并在室温下温育反应混合物2小时。标记的寡核苷酸(SLR14-647)进行乙醇沉淀并在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上纯化。

体内肿瘤注射和治疗

将5×10

流式细胞术分析

使用从BioLegend获得的以下抗小鼠抗体，进行染色和分析：抗-CD45(30-F11)、抗-CD3(145-2C11)、抗-CD4(GK1.5)、抗-CD8(53-6.7)、抗-CD44(IM7)、抗-FoxP3(MF-14)、抗-NK1.1(PK136)、抗-B220(RA3-6B2)、抗-CD11b(M1/70)、抗-Ly6G(1A8)、抗-Ly6C(HK1.4)、抗-CD11c(N418)、抗-I-A/I-E(M5/114.15.2)。使用eBIOSCIENCE

统计分析

数据呈现为均值±标准差。实验组之间的数值统计显著性通过配对t检验或单向方差分析(ANOVA)确定。p

如下讨论选择的结果。

肿瘤内注射SLR14导致显著的抗肿瘤作用：

皮下YUMMER1.7黑色素瘤小鼠模型被用于评估体内SLR14的抗肿瘤作用(图15A)。YUMMER1.7肿瘤是辐照的YUMM 1.7细胞，其携带三个驱动子突变：Braf

在i.t.注射5次剂量后，在SLR14-或CpG-治疗的小鼠中观察到显著的肿瘤生长延迟(图15B)。CpG具有比SLR14稍好的治疗功效。尽管载体治疗的小鼠中的肿瘤稍稍小于对照小鼠中的肿瘤，但是在这两组小鼠之间没有观察到统计学上显著的区别。图15C显示了每组小鼠中的个体肿瘤生长(n＝10)。根据动物实验标准对小鼠实施安乐死(肿瘤体积>1cm

SLR14和抗-PD1的联合治疗导致比单一治疗更好的抗肿瘤作用：

由于YUMMER1.7清除取决于T细胞，并且对免疫检查点抑制剂(包括抗-CTLA4和抗-PD1)敏感(Meeth,et al.,2016,Pigment Cell Melanoma Res 29(5):590-597)，对其检查SLR14和抗-PD1联合治疗是否提高单一治疗的抗肿瘤功效。为了该目的，荷YUMMER1.7小鼠如图16A中所描述产生并用SLR14(通过i.t.注射)、抗-PD1(通过腹膜内注射)或SLR14加抗-PD1进行治疗，进行总计5次给药。在单独用SLR14治疗的小鼠中检测到肿瘤生长的显著延迟。虽然在用单一抗-PD1治疗的小鼠中没有检测到显著的益处，但是在用SLR14和抗-PD1联合治疗的小鼠中观察到肿瘤生长的更加显著的延迟(图16B-16C)。这些发现指示了，当与免疫检查点抑制剂抗-PD1联合进行YUMMER1.7治疗时，SLR14诱导协同抗肿瘤作用。

SLR14主要被肿瘤微环境中的CD11b+髓样细胞吸收：

RIG-I在所有细胞类型(包括癌细胞)中广泛表达。在某些非限制性实施方式中，RIG-I配体可以在肿瘤细胞中触发RIG-I激活，直接导致癌细胞凋亡，或在免疫细胞(如DC)中触发RIG-I激活以诱导癌免疫原性细胞死亡(ICD)。

为了确定在i.t.注射后，SLR14靶向肿瘤细胞还是非肿瘤细胞，用Alexa Flour(AF)647标记SLR14并在肿瘤注射后12天时i.t.注射AF647-SLR14进入YUMMER17。一天后，收集SLR14-治疗的小鼠中的肿瘤并制备单细胞悬浮液用于通过流式细胞术进行细胞分析(图17A)。首先对肿瘤中总的活细胞的淋巴细胞或非淋巴细胞群进行门控，进行AF647+细胞分析。在淋巴细胞或非淋巴细胞群中分别存在3.13％或17.6％AF647+细胞(图17B-17E)。这些发现指示，在i.t.注射后，SLR14/jetPEI复合物主要被肿瘤中非淋巴细胞摄取。对于AF647+非淋巴细胞，其大部分是CD45+细胞(79.9％)，而小部分是CD45-细胞(18.7％)。进一步分析揭示了，这些CD45+AF647+细胞主要由CD11b+Ly6G+中性粒细胞(82％)和其他CD11b+细胞(包括Ly6C+CD11c+MHC II+DC和Ly6C+单核细胞或巨噬细胞)构成(图17B-17E)。没有进一步分析AF647+CD45-细胞的性质。不希望被任何实施方式限制，该群体可以包括一些肿瘤细胞，以及该环境中的其他基质细胞。本研究揭示了，在i.t.递送后SLR14主要被肿瘤内的CD11b+髓样细胞摄取。

肿瘤内SLR14递送增强细胞毒性T淋巴细胞以及髓样细胞的肿瘤浸润：

本研究指示了，SLR14主要被肿瘤微环境中的CD11b+髓样细胞以及非白细胞摄取，这指示了SLR14在YUMMER1.7中的抗肿瘤功效可以由ICD介导。为了进一步阐释哪些免疫细胞参与介导抗肿瘤免疫应答，建立荷YUMMER1.7小鼠并用SLR14、载体(jetPEI)或具有5％葡萄糖的水(无治疗)进行i.t.治疗，如图15A中所描述。最后一次治疗后三天，收获肿瘤并通过流式细胞术进行细胞分析。如图16A中所示，SLR14的i.t.治疗诱导肿瘤浸润CD45+白细胞的显著增加，其包括CD8+T细胞、B220+细胞、NK1.1+细胞和CD11b+髓样细胞，而CD4+FoxP3+调节T细胞(Treg)显著降低。注意，当与其他组小鼠进行比较时，发现在SLR14-治疗的小鼠中，CD8+/CD4+或CD8+/CD4+Treg比例的5-至6-倍增加(图16B)。此处，所有肿瘤浸润CD4+或CD8+T细胞是CD44+，这指示了它们被激活或可能抗原-经历。在治疗后，肿瘤微环境中的CD8+与CD4+FoxP3+Treg的比例与针对肿瘤的基于T细胞的免疫应答高度相关。

在某些非限制性实施方式中，肿瘤浸润T细胞(包括CD8+和CD4+Treg细胞)可以在SLR14-驱动的抗肿瘤免疫性中发挥重要作用。为了测试这一点，在RAG1-/-小鼠(缺少T细胞和B细胞)中建立YUMMER1.7肿瘤，并用SLR14或载体对这些动物进行i.t.治疗。在SLR14-治疗的和载体-治疗的小鼠之间没有观察到肿瘤生长的显著差异(图16C)，这指示了，在SLR14之后，需要适应性免疫应答用于清除YUMMER1.7肿瘤。

SLR14在B16F10黑色素瘤中展示了稳固的抗肿瘤作用：

在本文其他地方描述的实验中，免疫原性癌YUMMER1.7和MC38被用于评估SLR14体内的抗肿瘤功效。为了广泛地评价SLR14的抗肿瘤作用，在C57BL/6J小鼠中使用较差免疫原性的B16F10肿瘤，并评价SLR14治疗的作用(图19A)。在SLR14-治疗的小鼠中肿瘤生长被极大地抑制，而在对照(载体-治疗的或5％葡萄糖)中的肿瘤快速生长(图19B-19C)。而且，在最后治疗后12天依然可以检测到SLR14-治疗的小鼠中持续的肿瘤生长抑制，此时对照小鼠中全部肿瘤已经达到安乐死标准(肿瘤体积>1cm

SLR14在B16F10黑色素瘤中的抗肿瘤作用依赖于T细胞和非T细胞两者：

SLR14在较差免疫原性的B16F10肿瘤中显示了更有效的抗肿瘤作用。在某些非限制性实施方式中，SLR14的抗肿瘤作用依赖于细胞毒性T淋巴细胞。为了解决该问题，首先在RAG1-/-小鼠中产生皮下B16F10肿瘤并用与YUMMER1.7实验中相同剂量的SLR14或载体i.t.治疗动物(图20A)。与载体-治疗的肿瘤相比，即使在RAG1

肿瘤内SLR14递送诱导对未治疗的远距离肿瘤的有效远位作用：

SLR14可以靶向许多细胞(包括T和非T细胞)以诱导针对SLR14-治疗的B16F10的稳固的抗肿瘤应答。在某些非限制性实施方式中，SLR14还可以诱导荷B16F10小鼠中全身抗肿瘤免疫应答。为了研究该可能性，在首次接受试验的C57BL/6J小鼠中建立双侧皮下B16F10肿瘤。在肿瘤注射后7天，选择荷载具有相似大小的两个肿瘤的小鼠并用SLR14对仅一肿瘤进行i.t.治疗(图21A)。此处治疗方案与本文其他地方描述的实验中使用的方案完全相同。接受SLR14治疗的侧腹肿瘤的生长被极大地抑制，其与图19A-19E中所示结果一致。没有接受任何SLR14治疗的远距离肿瘤仍然比那些SLR-治疗的肿瘤大。然而，当与未治疗的对照相比时，它们显示了明显的生长延迟(图21B)。这些结果证明了，i.t.递送SLR14可以诱导对未治疗的远距离肿瘤的有效远位作用。

选择的评述：

抑制性肿瘤微环境是癌症免疫疗法成功的重要障碍。由于复杂的肿瘤微环境，肿瘤可分为两类：免疫原性和非免疫原性。目前，免疫检查点阻断(ICB)疗法已显示出持久的临床益处，但它的功效仅限于少数肿瘤具有免疫原性并已被T细胞预浸润的癌症患者。

如本文证明，在i.t.施用后，本发明考虑的RIG激动剂显示了在免疫原性和非免疫原性肿瘤中都具有有效的抗肿瘤活性。在免疫原性肿瘤中，本发明考虑的RIG激动剂显著增加肿瘤浸润CD8+T细胞和NK细胞，同时还极大地减少抑制性CD4+FoxP3+调节T细胞。在某些实施方式中，本发明考虑的RIG激动剂深刻地改变肿瘤微环境中细胞毒性淋巴细胞对免疫抑制细胞的比例，这导致强的抗肿瘤免疫应答。另外，联合疗法结果指示了，本发明考虑的RIG激动剂可以用作强力的免疫佐剂以增强其他免疫疗法(包括ICB)的功效。

令人惊讶地，在较差免疫原性的肿瘤中，本发明考虑的RIG激动剂显示了异乎寻常的抗肿瘤功效：肿瘤生长抑制和对未治疗的远距离肿瘤的远位作用，这暗示了RIG激动剂i.t.治疗可以改变局部肿瘤微环境，将非免疫原性肿瘤转变为免疫原性肿瘤，并诱导全身抗肿瘤免疫性。RIG激动剂单一疗法引起T细胞介导的ICD和非T细胞介导的肿瘤细胞死亡。

RIG激动剂被CD11b+髓样细胞摄取，并且这些髓样细胞是Ly6G+肿瘤相关中性粒细胞占主导，虽然其中少数是肿瘤相关DC(包括Ly6C+炎性DC子集)和单核细胞/巨噬细胞。CD8+T细胞介导的免疫应答是RIG激动剂的抗肿瘤功效的主要效应子。另外，肿瘤细胞还可能摄取RIG激动剂，因为约有20％的CD45-细胞显示了在其胞质中存在RIG激动剂。不希望受到任何理论的限制，这表明RIG激动剂可诱导直接肿瘤细胞凋亡。来自RAG1

本结果证明了，本发明考虑的合成RIG-激动剂通过激活不同细胞群中的胞质RIG-I信号传导途径诱导免疫原性或较差免疫原性癌症中有效的体内抗肿瘤作用。这些发现表明，合成RIG-I激动剂是对广泛癌症类型有希望的治疗药。

枚举的实施方式

提供以下示例性实施方式，其编号不应解释为指定重要性等级。

实施方式1提供治疗或预防受试者中癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的RIG-I激动剂。

实施方式2提供实施方式1的方法，其中受试者被进一步施用治疗有效量的免疫-检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4阻断剂或抗体。

实施方式3提供实施方式2的方法，其中在RIG-I抑制剂不存在的情况下，癌症对免疫-检查点抑制剂不显著应答。

实施方式4提供实施方式2-3中任一项的方法，其中免疫-检查点抑制剂是PD-1/PD-L1阻断剂(blockade agent)和/或CTLA-4阻断剂(blocking agent)。

实施方式5提供实施方式4的方法，其中PD-1/PD-L1阻断剂和/或CTLA-4阻断剂是小分子药物、多肽和/或抗体或其生物活性片段。

实施方式6提供实施方式4-5中任一项的方法，其中药剂包括选自以下的至少一种：德瓦鲁单抗、阿替唑珠单抗、阿维鲁单抗、纳武单抗、AMP224或GSK2661380、匹地丽珠单抗、派姆单抗、BMS936559、RG7446、伊匹单抗和替西木单抗。

实施方式7提供实施方式1-6中任一项的方法，其中RIG-1激动剂是能够诱导受试者中干扰素应答的多核糖核酸(RNA)分子。

实施方式8提供实施方式1-7中任一项的方法，其中RNA分子是：(i)双链的双链体，或(ii)单链分子，其包括第一核苷酸序列，其5’-端缀合至选自环和接头的元件的一端，其中元件的另一端缀合至第二核苷酸序列的3’-端，其中第一核苷酸序列基本上与第二核苷酸序列互补，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以杂交以形成双链区段，从而RNA分子形成发夹结构；其中在(i)或(ii)中的双链区段中碱基对的数目是范围从8至20的整数。

实施方式9提供实施方式8的方法，其中(ii)中的环包括至少一个核苷酸。

实施方式10提供实施方式8-9中任一项的方法，其中(ii)中的接头不含核苷、核苷酸、脱氧核苷、或脱氧核苷酸、或其任何替代物或修饰。

实施方式11提供实施方式8-10中任一项的方法，其中(ii)中的接头不含磷酸主链、或其任何替代物或修饰。

实施方式12提供实施方式8-11中任一项的方法，其中(ii)中的接头包括选自乙二醇基团、氨基酸、亚烷基链的至少一种。

实施方式13提供实施方式8-12中任一项的方法，其中接头包括(OCH

实施方式14提供实施方式8-13中任一项的方法，其中(ii)中的发夹具有平端。

实施方式15提供实施方式8-14中任一项的方法，其中分子具有3’-突出端。

实施方式16提供实施方式15的方法，其中突出端包括一个、两个或三个非碱基配对核苷酸。

实施方式17提供实施方式7-16中任一项的方法，其中RNA分子包括选自5’-三磷酸和5’-二磷酸的5’-末端基团。

实施方式18提供实施方式7-17中任一项的方法，其中RNA分子包括修饰的磷酸二酯主链。

实施方式19提供实施方式7-18中任一项的方法，其中RNA分子包括至少一个2’-修饰的核苷酸。

实施方式20提供实施方式19的方法，其中至少一个2’-修饰的核苷酸包括选自以下的修饰：2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)。

实施方式21提供实施方式7-20中任一项的方法，其中RNA分子包括至少一个修饰的磷酸基团。

实施方式22提供实施方式7-21中任一项的方法，其中RNA分子包括至少一个修饰的碱基。

实施方式23提供实施方式7-22中任一项的方法，其中双链区段包括一个或多个错配的碱基。

实施方式24提供实施方式7-23中任一项的方法，其中RNA分子包括至少一个无碱基核苷酸。

实施方式25提供实施方式1-24中任一项的方法，其中癌症是免疫原性的。

实施方式26提供实施方式1-24中任一项的方法，其中癌症不是免疫原性的。

实施方式27提供实施方式1-26中任一项的方法，其中癌症是选自以下的至少一种：黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病和肺癌。

实施方式28提供实施方式2-27中任一项的方法，其中免疫-检查点抑制剂和RIG-I激动剂共施用和/或以近似相同的时间施用至受试者。

实施方式29提供实施方式1-28中任一项的方法，其中RIG-I激动剂肿瘤内施用至受试者。

实施方式30提供实施方式1-29中任一项的方法，其中RIG-1激动剂在受试者中具有远位作用。

实施方式31提供包括免疫-检查点抑制剂和RIG-I激动剂的药物组合物。

实施方式32提供实施方式31的药物组合物，其中RIG-1激动剂是能够诱导受试者中干扰素应答的RNA分子。

实施方式33提供实施方式31-32中任一项的药物组合物，其中RNA分子是单链分子并且包括第一核苷酸序列，其5’-端缀合至选自环和接头的元件的一端，其中元件的另一端缀合至第二核苷酸序列的3’-端，其中第一核苷酸序列基本上与第二核苷酸序列互补，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以杂交以形成双链区段，其中双链区段中碱基对的数目是范围从8至20的整数，从而RNA分子形成发夹结构。

本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本文。尽管已经参考特定实施方式公开了本发明，但是显然，本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方式和变型而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。