SDS

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是由Ulrich K. Laemmli开发的一种不连续的电泳系统，通常被用来分离分子质量在5到250 kDa之间的蛋白质。十二烷基硫酸钠（SDS，也被称为十二烷基硫酸钠）和聚丙烯酰胺凝胶的联合使用可以消除结构和电荷的影响，蛋白质仅根据其分子量的差异被分离。在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE是必不可少的，通常用于检测蛋白的表达情况（目的蛋白的表达量、表达分布、纯度等）。

1. SDS-PAGE的原理

SDS-PAGE的原理是，当置于电场中时，带电分子会以相反的信号迁移到电极上。带电分子的分离取决于带电分子的相对迁移率。

由于电泳过程中阻力较小，较小的分子迁移得更快。蛋白质的结构和电荷也影响迁移的速度。十二烷基硫酸钠和聚丙烯酰胺消除了蛋白质的结构和电荷的影响，蛋白质根据多肽链的长度被分离。

2. SDS在SDS-PAGE中的作用

SDS是SDS-PAGE样品缓冲液中的一种洗涤剂。SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；而DTT（或β-巯基乙醇）是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。

3. 样品处理方法

根据样品分离的目的进行分类，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

Ø 还原SDS处理

在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇），使蛋白质构象被解离，电荷被中和，从而形成了SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量大小分离。一般情况电泳均按这种方式处理。

样品稀释至适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

Ø 带有烷基化作用的还原SDS处理

碘乙酸胺的烷基化作用可以长期牢固的保护SH基团，从而得到较窄的谱带；另外，碘乙酸胺也可以捕集过量的DTT，防止银染时的纹理现象。

100μL样品缓冲液中10μL 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

Ø 非还原SDS处理

样品中只加入SDS，而不加DTT还原剂，此时二硫键不能断裂，所以蛋白没有完全去折叠，保持一定的4级结构。适用于生理体液、血清、尿素等样品。

一般只用1%SDS沸水中煮3min，不可作为测定分子量来使用。

4. 染色方法

在电泳分离结束后，所有的蛋白质按大小分类，然后可以用其他方法进行分析，例如蛋白质染色，如考马斯亮蓝（最常见、最容易使用）、银染（灵敏度最高）、全染色、氨基黑10B染色、固绿FCF染色等。跑胶时，一般同时加入分子量标记（Marker）来估计大小。下图左为考马斯亮蓝染色结果，右为银染结果。

5. SDS-PAGE电泳常见问题及解决方案

问题

原因

解决方案

胶条出现两边翘起中间凹下现象

凝胶的中间部分凝固不均匀，多出现于较厚的凝胶中

待其充分凝固再作后续实验

胶条出现两边向下中间鼓起

两板之间的底部间隙气泡未排除干净，多出现在蛋白质垂直电泳槽中

可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡

条带出现拖尾

样品融解效果不好或分离胶浓度过大

加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度

条带出现纹理现象

样品是不溶性颗粒

加样前离心；加适量样品促溶剂

溴酚蓝没有起到指示作用（溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质还未跑下来的现象）

缓冲液和分离胶的浓度

更换正确pH的缓冲液；降低分离胶的浓度

蛋白带过宽

加样过多或漏液

适当减少上样量

电泳电压很高而电流却很低

这种现象一般初学者比较容易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽装配错误，电流未形成通路。其中包括：1.内外槽装反；2.外槽液过少；3.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）

正确装配电泳槽