单细胞RNA测序入门指南

作者：Lyric

1.为什么做单细胞测序

世界上没有两片相同的树叶，对于多细胞生物而言，其细胞与细胞之间也存在着差异，且不同群体细胞间的差异不一。这种差异不仅体现在形态上，也体现在遗传信息上，例如基因组信息、基因表达水平等。虽然同一个体所有细胞均来自于同一个受精卵，理论上细胞间基因组是一致的，但是在细胞分裂和分化过程中，由于内部随机生物过程和外部环境扰动的影响，会导致细胞DNA序列发生改变，比较典型的例子是肿瘤细胞VS正常细胞、不同肿瘤细胞亚型（肿瘤异质性）（图1）。

在基因表达层面上，不同的细胞也具有独特的转录组，例如心肌细胞和神经细胞，而即便是那些看似相同的细胞集合，细胞之间的表达水平也存在巨大差异[1]。而细胞间遗传物质的差异会导致细胞的异质性。

人类基因组计划（HGP）完成后，随着测序技术尤其是高通量测序技术的迅速发展，人们对基因组变异/基因表达差异与表型之间关系的认识越来越深刻。然而传统的Bulk 测序手段是针对细胞集合进行测序，即所使用的材料是组织样本或一大群培养细胞，针对这类样本的研究反映的是特定组织/细胞集合的平均水平，或者是特定组织/细胞集合的代表性信息，而同一组织往往是由多种细胞类型构成，且单个细胞间表达的信息也千差万别，因此常规Bulk 测序时单个细胞特异性的信息往往被掩盖，导致错失很多重要信息。

随着现代生物学的发展，常规Bulk 测序研究已经不能满足科研需求，2011年，《Nature Methods》将单细胞测序列为年度值得期待的技术之一[2]；2013年1月，《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首[3]；2014年1月，《Nature Methods》将单细胞测序列为 2013 年度最重要的方法学进展，并且指出刊登在《Nature》系列杂志上的单细胞测序文章在2013年出现了大爆发[4]。因此单细胞测序正在成为科研热点。

2.单细胞RNA测序

单细胞测序可以分为单细胞DNA测序（单细胞基因组测序）和单细胞RNA测序（单细胞转录组测序），细胞是生命活动的基本单位，1个细胞中含有的RNA只有1-10pg，这么少的量远远达不到现有测序仪的最低上样需求，因此对于单细胞RNA测序，首先要解决的问题是RNA扩增。

1990年，Norman Iscove课题组，使用PCR技术实现了对cDNA分子的指数级扩增，首次证实对单细胞进行转录组分析是可行的[5]。

20世纪90年代初期，Eberwine等人发明了一种新技术，能够从单个活神经元细胞中获得cDNA，并且再以这些cDNA为模板转录生成RNA，实现RNA