RNA琼脂糖凝胶电泳图常见问题有哪些？如何解决？

RNA的提取质量直接关乎后续的实验结果。但在RNA实际提取过程中，我们经常会翻车。

RNA降解，亮度比较均衡地衰减

（图1来源丁香园论坛，若有侵权联系删除）

总RNA非变性电泳显示28S 不如18S 亮；

图2来源琼脂糖凝胶电泳实验技巧及异常分析

RNA凝胶电泳的加样孔有荧光

图3来源琼脂糖凝胶电泳实验技巧及异常分析

由此可见，想要提取高质量的RNA并非易事，今天小凡将从凝胶电泳的原理、实验失败常见原因、RNA提取和纯化方法（磁珠法和trizol法）这几方面阐述RNA提取的注意事项，以辅助后续实验的顺利进行。

当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。

由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯先胺胶等，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。

在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子状态，从这种意义上讲，DNA和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的RNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。

在一定的电场强度下，RNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的RNA分子比分子量较大的RNA分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离RNA片段的基本原理。

RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌灯，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。

1、RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等；

2、严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可以存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染；

3、最大限度地抑制内源性的RNA酶，而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：有高致癌性；

2、异硫氰酸胍、滤仿：有毒试剂；

3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）

一直以来，完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面研究工作的前提，常用的提取方法包括Trizol法和磁珠法。

1、Trizol法提取RNA原理

Trizol试剂盒是一种ben酚与异硫氰酸胍（GTC）的混合物，GTC可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯方可抽提核酸性的ben酚，而酸性ben酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。

整个提取过程使用有毒试剂，RNA容易降解，并且操作过程繁琐，难度大。

2、磁珠法提取RNA原理

磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大，安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯方等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少，完全符合现代环保理念。并且不涉及RNA酶的处理问题，提取得到高纯度总RNA。

3、比较结果如下

1、细胞RNA提取试剂盒

※ 适配高通量自动化核酸提取仪，最少人工操作时间；※ 样本制备时间短，样品前处理需10min，全自动核酸提取仪50min；※ 样本间差异低，结果重复性强；※ 纯度高，无DNA污染；※ 可处理细胞数量级范围5x104~106

2、组织RNA提取试剂盒

※ RNA纯度高（OD260/280 1.8-2.0）；

※ 高收率，无降解；

※ 无高分子量DNA污染（DNase I处理）；

※ 适用多种样本类型；

※ 手工操作时间短；

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参考文献：

刘阳、杨淑霞、赖翼等.影响琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的因素[J].生物学杂志,2009,26(2):70-72.DOl:10.3969/j.issn.1008-9632.2009.02.070.