HPLC

柯庆青，李诗言，贝亦江，周凡，郑重莺，王鼎南，丁雪燕，王扬

(浙江省水产质量检测中心，浙江 杭州 310023)

近些年来，随着水产养殖业的不断发展，水产品的质量安全问题逐渐引起人们关注。磺胺类(SAs)和喹诺酮类(QNs)药物是人畜通用的抗生素类药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、作用迅速等特点，在畜牧、水产等养殖业中常作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物[1-2]。磺胺和喹诺酮类抗生素具有一定的毒副作用，长期摄入含有磺胺和喹诺酮类的动物源食品，会导致抗生素在人体内残留蓄积，使人体产生耐药性并影响人体健康。中华人民共和国农业农村部235号公告要求，动物源性食品中磺胺类兽药残留总量不大于100 μg·kg-1，恩诺沙星(恩诺沙星+环丙沙星)限量为100 μg·kg-1[3]。渔用配合饲料是水产品养殖中重要的投入品之一，其质量直接关系到水产品的品质和安全。因此，建立饲料中磺胺类和喹诺酮类药物的快速检测方法对饲料的安全监管具有重要的意义。

磺胺类和喹诺酮类药物的化学性质相似，比较容易用同一种方法提取，同时检测。目前检测磺胺类和喹诺酮类药物的方法主要有酶联免疫法(ELISA)[4-5]、毛细管电泳法(CE)[6]、液相色谱法(HPLC)[7-9]、液相质谱法(LC-MS)[10]、液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)[11-17]等。其中毛细管电泳法灵敏度较低、选择性较差；酶联免疫法结果易出现假阳性，因此只能作为筛选方法；液相色谱法由于只靠保留时间定性，抗干扰能力较弱；液相质谱法虽然方法的灵敏度较高，但难以完全阐明目标化合物结构裂解的信息，准确定性方面有所欠缺。液相色谱串联质谱法具有定性能力强，选择性好，灵敏度高等优点，近年来，高效液相色谱串联质谱法在兽药残留分析中得到广泛应用。目前，采用高分辨、全扫描技术的四级杆-飞行时间质谱(Q-TOF)可以对多组分化合物进行精确的分子量测定，并可以通过与建立的化合物数据库进行匹配检索，快速、便捷地对目标化合物和未知化合物进行筛查和确定，具有灵敏度高、选择性好、受基体干扰小、定性准确度高等优点。目前国内外基于Q-TOF对多组分化合物筛查的研究已涉及食品、医药、环境安全等多个领域。渔用饲料安全密切影响着水产品的质量安全，目前采用Q-TOF技术对渔用饲料中的磺胺类和喹诺酮类多组分药物残留的检测分析研究相对较少。为建立一种高效、低干扰的渔用配合饲料中磺胺类和喹诺酮类药物检测方法，本方法采用酸化乙腈-乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)溶液提取体系进行提取，利用乙腈沉淀和冷冻离心的方式减少蛋白质干扰，采用新一代反相固相萃取吸附剂，在不用平衡活化的情况下有效地去除样品中的脂肪和磷脂，较以往固相萃取剂具有更简单、更快速、更洁净的优势[18]。同时，本研究利用高分辨高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC-Q-TOF/MS)技术建立了7 min内快速筛查和定量检测渔用配合饲料中的15种磺胺类和喹诺酮药物残留的方法，为饲料中非法药物添加的监控提供更高效、准确的技术手段。

1.1.1 待测样品

饲料样品均来自2016年浙江省水产质量检测中心水产投入品监督抽查任务，所有样品避光常温保存，待检测。

1.1.2 试剂

磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺对甲氧基嘧啶、磺胺间甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺二甲基哒嗪、磺胺喹恶啉、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星，德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度均大于95%；乙腈(色谱纯)，美国TEDIA公司；甲醇(色谱纯)，美国TEDIA公司；甲酸(色谱纯)，美国ROE Scientific Inc.公司。

1.1.3 仪器

1290-6540液相色谱、四级杆飞行时间质谱仪，美国安捷伦公司；2202S型电子天平，德国赛多利斯有限公司； TDL-5A离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；Centrifuge 5427R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；N-EVAP112水浴式氮吹浓缩仪，美国 Oranomation Aassociates Inc.公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱、0.22 μm GHP过滤头，美国 Waters公司。

1.2.1 样品前处理

取1.00 g饲料样品于15 mL带盖聚乙烯离心管中，加入10 mL 0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液，涡旋均匀30 s后加入10 mL 0.1%甲酸乙腈，高速振荡10 min，放入冰箱冷冻20 min后，5 000 r·min-1离心5 min，取一半体积上清液过0.22 μm GHP滤头后氮吹近干，加入3 mL超纯水复溶后，将提取液加入Oasis PRiME HLB固相萃取柱，保持每秒1滴的流速流出，10%甲醇水溶液淋洗，6 mL甲醇洗脱，收集洗脱液在40 ℃下氮气吹干，用0.1%甲酸乙腈∶水为1∶9的流动相定容至1 mL，漩涡使其充分溶解后加入1 mL正己烷，快速漩涡1 min， 4 000 r·min-1离心5 min，弃去正己烷层后过0.22 μm微孔滤膜，上机测试。

1.2.2 色质谱条件

以0.1%甲酸溶液(流动相A)和甲醇(流动相B)溶液为色谱流动相进行梯度洗脱。色谱柱为Aglient Plus C18(3.0 nm×100 nm，1.8 μm)，流速为250 μL·min-1，柱温30 ℃。梯度洗脱程序设定为：0～1 min，5% B；1～5 min，5%～30% B；5～8 min，30%～50% B；8～15 min，50%～98% B；15～18 min，98% B。

离子源为Dual AJS ESI源，扫描方式为正离子全扫描，全扫描范围：m/z50～1 000，毛细管电压4 000 V，鞘气温度400 ℃，鞘气流速12.0 L·min-1，干燥气流,8.0 L·min-1，干燥气温度325 ℃，诱导解离电压130 V。采集数据时采用参比液(C5H4N4，其离子精确相对质量为121.050873)实时进行质量校准。

2.1.1 提取试剂的选择

渔用配合饲料主要来源于动物源原料(鱼粉、蚕蛹等)和植物性原料(豆饼、菜籽饼、谷实类等)，在检测兽药残留的过程中主要干扰物有蛋白质、脂肪、色素、糖类等，因此选择合适的前处理方法尤为重要。

配合饲料基质较为复杂，单一试剂提取杂质较多，会给后期的净化带来困难，经过试验优化，本试验采用酸化乙腈-0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液提取体系。在加入有机溶剂提取前，先用0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液对样品进行处理。有研究发现，在加入有机溶剂前，用水将样品分散可增加大部分药物的提取回收率[19]，这可能由于水提前加入均质可以将饲料样品充分分散，增大了有机溶剂和样品的接触面积，有利于水溶性药物的溶解，同时螯合剂Na2EDTA的加入可络合饲料中存在的大部分金属离子，可改善喹诺酮类药物的峰形，提高提取回收率。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯是常见的提取试剂，相较于甲醇和乙酸乙酯，乙腈具有较强的提取效率且具有沉淀蛋白的作用。由于磺胺类和喹诺酮类药物都具有酸碱两性性质，与纯乙腈相比，0.1%甲酸乙腈提取效率更高。本实验采用酸化乙腈-0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液提取后，提取液放入冰箱冷冻20 min后离心取上清液，加入乙腈，冷冻后使得蛋白沉淀。本实验对比了水、乙腈分步提取和乙腈水溶液直接提取方法，发现用前者提取，上清液更澄清，提取回收率更高。若加入的有机溶剂比例过低，药物的回收率偏低，当加入的有机溶剂比例为50%时，所有化合物的回收率均能较好地满足分析要求方法。因此，本研究选用10 mL 0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液及10 mL 0.1%甲酸乙腈为提取溶剂。

2.1.2 净化方法的选择

目前饲料中药物残留检测的前处理方法主要有QuECHERS方法和固相萃取法。本研究对2种方法进行了比较和选择，在使用QuECHERS方法的过程中，由于饲料成分复杂，基质效应较大，基质干扰较为明显，常用的吸附剂如PSA、GCB等对部分目标药物有一定的吸附，导致方法的灵敏度较低。

样品经过乙腈沉淀及冷冻离心后已经去除了大部分蛋白质，但仍可能存在少量的脂肪、色素等杂质。本研究采用了新型反相固相萃取Oasis PRiME HLB固相微萃取柱对提取液进行净化， 可有效去除脂肪、磷脂、部分色素等杂质干扰，且填料具有水可浸润性，无须活化和平衡，在高水相的情况下，填料对目标化合物有较好的保留和较高的载量，蛋白质等杂质不被保留而与目标物分离。用高洗脱强度的有机试剂将目标化合物洗脱收集，而部分动物性油脂非极性杂质则会保留在小柱上，有效实现目标化合物和杂质的分离。且从塔板理论来说，固相微萃取小柱塔理论板数为几百，相较于塔板数为1的QuEchERs的通过策略，固相微萃取净化效率较高。因此本研究预处理采用Oasis PRiME HLB固相微萃取柱进行富集、净化。由于乙腈洗脱能力过强，可将色素等杂质一起洗脱下来，故选择甲醇为洗脱液。

磺胺类和喹诺酮类药物均溶于甲醇，选择甲醇-水体系作为流动相，由于磺胺类和喹诺酮类均属于两性物质，色谱峰较易拖尾，在流动相中加入0.1%甲酸，可以一定程度上改善峰型，并且增强离子化效率，提高检测灵敏度。由于不同药物的极性有所差异，采取梯度洗脱的方式进行洗脱，7 min内可完成15种药物的分析(图1)。

1，磺胺嘧啶；2，磺胺吡啶；3，诺氟沙星；4、氧氟沙星；5，环丙沙星；6，磺胺二甲基嘧啶；7，丹诺沙星；8， 磺胺对甲氧基嘧啶；9，恩诺沙星；10， 磺胺间甲氧基嘧啶；11，沙拉沙星；12，磺胺甲噁唑；13，磺胺邻二甲氧嘧啶；14，磺胺二甲基哒嗪；15，磺胺喹恶啉图1 15种磺胺和喹诺酮药物的提取离子流

化合物筛查数据库是筛查目标兽药的判定依据，本研究通过 Agilent Mass Hunter Workstation软件(Version B 5.00)完成各化合物数据的采集与处理，Agilent Mass Hunter PCDL Manager软件(Version B 4.00)完成化合物筛查数据库的建立。建立化合物筛查数据库时，在相同流动相的情况下，将一定浓度的磺胺类和喹诺酮类的标准溶液以正离子模式进行一级质谱扫描，找出各个化合物的母离子。进一步对母离子进行子离子扫描，得到各个化合物的二级质谱图和特征子离子信息。为了保证筛查数据的完整性和可靠性，分别采集了毛细血管电泳为10、20和40 eV时各化合物的二级质谱图加入谱库，建立包括化合物精确分子量、保留时间、特征离子碎片信息的化合物数据库。欧盟 2002/657/EC 决议要求，当使用高分辨质谱作为确证技术时，化合物的确证需要至少4个鉴别分数，其中检测到1个结构碎片获得2个鉴别分数，二级质谱中的每个子离子获得2.5个分数，即1个具有精确质量数的母离子和 1个特征碎片子离子即可获得4.5分的鉴定分数。本研究所建立的HPLC-Q-TOF/MS检测方法中，每个化合物已经确证至少1个精确质量数的母离子和2个特征子离子，满足超过4分的鉴定确证分数点的条件。表1列出了15种化合物的精确质量分子量、保留时间和特征离子碎片等信息。利用已建立好的数据库对样品进行药物筛查，HPLC-Q-TOF/MS检测筛查得分高于70分的兽药(得分依据为精确质量数、保留时间和同位素丰度)，对初筛筛查出的兽药采用建立好的Target-MS/MS方法进行检测，从而获得目标兽药的碎片离子信息，并进行二级离子比对确证，通过基质加标的形式，消除基质效应，并通过外标法利用母离子对筛查出的化合物进行定量。

表1 15种目标物的保留时间以及质谱参数

由于饲料基质较为复杂，基质物质对目标化合物的分析过程有一定干扰。本实验利用空白饲料样品的基质溶液配制标准溶液进行定量分析，使标准曲线和实际样品有相同的离子化环境，以减少基质效应对检测的干扰。在选定的色谱条件和质谱参数下，以渔用配合饲料空白基质溶液配制6种质量浓度的混合标准工作溶液上机测试，15种药物均以峰面积(Y)为纵坐标，对应的质量浓度(X，μg·L-1)为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程(表2)。结果表明，15种待测物的线性范围均为10～500 μg·L-1，相关系数(R2)为0.988～0.997，表明各化合物具有良好的线性关系。采用标准添加法进行测定，以离子信噪比(S/N)>3确定样品的检出限(LOD)，S/N>10为定量限(LOQ)，得到15种化合物的LOD范围为3.0～8.0 μg·kg-1，LOQ范围为10.0～25.0 μg·kg-1。

为了考察检测方法的可行性，向空白饲料样品中添加3个浓度水平的15种兽药的混合标准溶液，每组做6个平行，按照上述前处理方法和仪器条件进行测定，回收率和精密度结果见表3。

表2 15种目标物的线性方程、相关系数、 检出限和定量限

表3 饲料中15种目标物的平均加标回收率和 精密度

对浙江省投入品监督抽查任务中抽查的80批次渔用饲料进行检测，结果显示，抽检的饲料均无上述磺胺类和喹诺酮类药物添加。考虑在实际生产中一般在饲料投喂前进行拌药，而养殖生产现场抽取的基本上是未启封的包装饲料。在这个环节监控上，存在一定风险，所以饲料和渔用饲料的药物残留问题仍需连续监测。

本试验采用Oasis HLB固相萃取柱净化方法对渔用配合饲料进行前处理，通过对前处理方法改进，色质谱条件优化，依据建立的化合物数据库，建立了渔用配合饲料中9种磺胺类和6种喹诺酮类药物的HPLC-Q-TOF/MS筛查方法。该方法具有简单、灵敏、适用范围广等特点，适用于饲料中多种磺胺类和喹诺酮类药物的快速筛查分析，其灵敏度和准确度均能满足兽药残留检测分析的要求，为饲料的质量安全监管工作提供有力工具。

浙江农业科学2019年1期