收下师姐的这份慢病毒转染全攻略

三．慢病毒感染细胞实验步骤

慢病毒对不同细胞系亲嗜性不同，在使用慢病毒前可以查阅相关文献，了解慢病毒对目的细胞系的感染复数MOI值（MOI在用于病毒感染细胞的研究中时，含义是感染时病毒与细胞数量的比值）。如果无相关文献支持，可以通过预实验获取合适的MOI值。

以24孔培养板为例，进行目的细胞系和293T细胞（平行对照）的感染预实验，按照不同的MOI值设置若干感染孔（可依据经验值设置3个左右梯度），并根据MOI值和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

(1) Day 1，准备细胞：在 24 孔培养板接种若干孔处于对数生长期的目的细胞和平行对照293T细胞，铺板时细胞融合率为50%左右，每孔加入100 μL培养基，培养箱中培养至细胞贴壁（针对贴壁细胞），进行病毒感染时细胞的最佳融合度为 70% 左右。

(2) Day 2，准备病毒: 4°C保存的病毒，取出后轻轻用移液器混匀; -80℃冻存的病毒在冰上融化后使用。

接着感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，观察细胞生长状态，如细胞状态好（细胞状态对转染影响较大），则可以开始实验。

a.吸去培养器皿中的旧培养基，用PBS清洗两次，更换新鲜培养基（如果细胞生长良好，没有大量漂浮细胞，培养基没有变色，则不用换液）。

b. 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入目的细胞和对照细胞中。

c.将病毒液和培养基混匀，放于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2)孵育培养。

(3) Day 3（加入病毒液 24 小时后），弃去含病毒的培养液，换上新鲜完全培养液，继续在培箱中进行培养（该时间可根据实验情况具体调整，笔者所在课题组为8小时换液）。

(4) Day 4（加入病毒 48-72小时后），对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 荧光强度，对于携带 Puromycin 抗性基因的病毒，换上含适当浓度Puromycin完全培养液（Puromycin 标准终浓度范围为 1-10 μg/mL，不同细胞系Puromycin工作液浓度不同，可查阅文献或者预实验寻找最适Puromycin筛选浓度），筛选出稳定表达的细胞株。

转染48小时HepG2 细胞GFP荧光强度

(5) 稳定细胞株筛选：将Puromycin筛选后的细胞进行传代，并继续持续施加合适浓度Puromycin 维持抗性，连续筛选并传3代后，冻存保存稳定表达细胞株。

四．慢病毒感染注意事项

1. 进行病毒操作时最好使用专用生物安全柜，避免污染。

2. 必要时可使用病毒感染增强剂来提高病毒感染效率（Transdux），笔者所在课题购自SBI（https://systembio.com/shop/transdux-max-lentivirus-transduction-enhancer/）。

图片来源于SBI官网

3. 在转染后，如果目的细胞系GFP荧光强度弱，可观察293T平行对照组荧光强度，如果293T荧光强度也弱，需要考虑病毒液本身的问题，如果293T荧光强度正常，就需要考虑是不是目的细胞系属于难转染细胞系等其他原因。

4.在转染过程中常常遇到加入病毒液后或者加入Puromycin筛选后细胞状态极差的情况，这个时候细胞通常比较脆弱，在已经确定好病毒液的量或者Puromycin筛选浓度时，多考虑是不是在转染时细胞本身状态不够好（比如笔者遇到过传多代的细胞会难转染的情况）。

5.如果加Puromycin后细胞死亡较多，需要及时换液，以防死细胞释放的有害物质影响具有抗性的细胞生长。

6.像HepG2细胞具有聚集生长的特性，如果加Puromycin后死亡的细胞较多，剩下的HepG2细胞比较稀松，细胞也很难长起来。

以上为笔者的一些个人实验经验，不代表所有实验情况，总之希望大家在平时的实验过程中都多交流，多查阅相关文献资料，早日出成果。

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/eNrLZAmYTYbW_dipyaA4bg返回搜狐，查看更多