一种丹参酮IIAPEG‑PLGA‑PEG纳米粒及其制备方法与流程

本发明涉及医药技术领域，涉及一种包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备方法及用途。

背景技术：

丹参酮iia（tanshinoneiia）为二萜醌类化合物，是临床常用活血化瘀中药丹参的主要有效成分之一，属于脂溶性的药物，易溶于有机溶剂，是一种天然的抗氧化药物。丹参酮iia具有广泛的药理作用，丹参酮iia可以通过保护血管内皮细胞、降低体内过氧化脂质、免疫调节等多种方式，起到改善动脉粥样硬化的作用。临床研究发现，丹参酮iia还具有抑制心肌细胞凋亡作用，在治疗心血管疾病的发展中起关键的作用；丹参酮iia不仅在治疗心血管疾病方面有广泛的应用，对于缺血缺氧引起的大脑中枢神经系统损伤也有显著的治疗效果。药理学实验已经证明，丹参酮iia的抗炎、抑制细胞凋亡、抗氧化及清除氧自由基的作用，可以用来治疗脑缺血等疾病并且效果非常明显。

虽然丹参酮iia在治疗很多脑部疾病方面有广泛的药理活性，但是在药物研发上还有许多问题没有得到解决，比如丹参酮iia难溶于水，制成水溶性制剂存在困难，且血液循环半衰期短、生物利用度低、跨越血脑屏障的渗透性差等，因此限制了丹参酮iia在临床的应用。目前，主要是通过磺酸化反应对丹参酮iia进行结构修饰，转化为水溶性的丹参酮iia磺酸钠注射液，但是由于丹参酮iia磺酸钠在血液中半衰期短，快相和慢相分别为26min及108min，因此必须用较大剂量（160mg/250ml/日）进行静脉滴注【邵鹤生，景锡南，殷兰琴，顾建峰，赵敏敏。丹参酮iia磺酸钠在大鼠体内的分布排泄和代谢的研究，《中成药研究》1979，2：8-12】。此外，磺酸钠盐为离子型化合物，较难通过以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统，使得丹参酮iia的利用率不高，大幅度降低了丹参酮iia的治疗效果，而且反复给药对正常器官组织的副作用较大。

随着纳米技术的快速发展，直径小于100nm纳米材料的在生物医学领域得到了广泛的应用，尤其是在医学成像、疾病诊断、药物靶向递送、癌症精准治疗、基因转染等领域。脑血管疾病的治疗，由于血脑屏障的阻碍，大约有98%的亲水性小分子和绝大多数大分子都不能通过，使药物分子难以达到病灶处，限制了对脑血管疾病的临床疗效。而纳米药物载体由于优良的生物相容性、可修饰性等特性，成为脑靶向递药系统研究的热点之一。研究发现，采用纳米载药系统负载化学治疗药物、多肽、蛋白质药物，能实现缓释、控释和靶向给药的目的，使得这类药物不会在很短的时间内被降解和清除，从而减少注射给药频率，提高患者的顺应性同时，经过特异性靶向配体修饰后，可携载药物分子透过血脑屏障，显著提高药物在脑组织病变部位的有效浓度，达到精准治疗脑部疾病的目的。降低其它非病变部位的药物浓度，减少对机体的毒副作用。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid),plga)是由乳酸(lacticacid,la)和羟基乙酸(glycolicacid,ga)按照不同比例聚合而成的一种功能性高分子有机材料，已经通过美国的食品药品监督管理局(fda)认证。目前，已被广泛用于制备人工导管，药物缓释载体(微球、纳米粒、微丸)，埋植剂以及膜剂等制【acharyas,sahoosk.plgananoparticlescontainingvariousanticanceragentsandtumourdeliverybyepreffect.advdrugdelivrev.2011,63(3):170-183.；chenyc,liudz,liujj,etal.developmentofterbinafinesolidlipidnanoparticlesasatopicaldeliverysystem.intjnanomedicine.2012,7:4409-4418.】。作为纳米药物载体plga具有以下优点：①由乳酸(la)和羟基乙酸(或称乙醇酸，ga)聚合而成，合成工艺成熟；②具有可控的粒径，纳米粒分散度小；③具有良好的生物降解性和生物相容性的、无免疫原性；plga共聚物在人体内最终的降解产物是二氧化碳(co2)和水(h2o)，并且可以通过正常的生陈代谢排出体外，因此对人的身体没有刺激性和毒性。④能够实现药物的长时间缓释（数周或数月），降低了用药频率，提高患者顺应性；⑤经修饰后的plga纳米粒，适于包埋生物活性分子如蛋白、基因dna，疫苗等；⑥在plga表面修饰配基后，可实现药物的靶向递送【chohj,yoonis,yoonhy,etal.polyethyleneglycol-conjugatedhyaluronicacid-ceramideself-assemblednanoparticlesfortargeteddeliveryofdoxorubicin.biomaterials.2012,33(4):1190-1200.；collinsmnbirkinshawc.hyaluronicacidbasedscaffoldsfortissueengineering-areview.carbohydrpolym.2013,92(2):1262-1279.】。利用纳米载体peg-plga-peg包载丹参酮iia，可以改善丹参酮iia的亲水性、生物相容性、生物利用度低等问题。纳米粒表面的亲水性与亲脂性将影响吞噬细胞对其吞噬的快慢，因而要延长丹参酮iia在体内的血液循环半衰期需增加plga表面的亲水性。因plga嵌段结晶性较强，且有疏水性，所以极易被res清除，很难将药物到达靶向部位。而peg-plga-peg三嵌段共聚物具有亲水性，且生物相容性好，无毒性、抗原性和免疫原性，易溶于水和许多有机溶剂。通过与plga共聚合成peg-plga-peg，可以将peg和plga的优点结合起来，有效延缓res的清除，延长体循环时间。

技术实现要素：

针对上述丹参酮iia传统制剂的技术问题，本发明的目的在于提供一种包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备方法，该方法过程简单，重现性好。利用这种方法制备的丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒，大小均一、具有明显的球状结构、稳定性好，载药量和包封率均较高，分散性好，丹参酮iia载药纳米粒在体内的循环半衰期明显延长，不易被res清除。

本发明提供一种包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒：是用三嵌段共聚物peg-plga-peg包载亲脂性药物丹参酮iia，经过冷冻干燥后，得到性质稳定、大小均一，加水复溶后溶解性好的载药纳米粒。

所述的三嵌段共聚物peg-plga-peg纳米载体材料，其分子量为10000～60000；其中，plga的含量为40%～96%，分子量为2000～30000，合成plga过程中乙交酯与丙交酯的比例为1/100～99/100；其中peg的含量为4%～60%，分子量为1000～5000。

所述的丹参酮iia的质量分数为80%～98%；乳化剂的类型为：吐温80、聚乙烯醇（pva）、泊洛沙姆188、大豆磷脂或卵磷脂其中的一种或几种的混合物，在内水相和外水相中的质量分数为0.1%～10%；所述的纳米粒径的范围为100～400nm，纳米粒中丹参酮iia的载药量10%～35%，包封率50%～90%。

一种包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备方法，工艺如下:

（1）将丹参酮iia和peg-plga-peg溶解在混合有机溶剂中作为油相，将乳化剂溶于去离子水作为内水相；

（2）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（1）中的内水相缓慢滴加到有机相中，超声形成初乳；

（3）将乳化剂溶于去离子水中作为外水相（外水相和内水相中所用的乳化剂为同一种乳化剂），在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（2）中的初乳，深入外水相的液面下，缓慢滴加超声震荡形成复乳；

（4）采用搅拌的方式除去复乳中的有机溶剂，将纳米混悬溶液高速离心，用去离子水反复清洗超声分散，用微孔滤膜过滤后冷冻干燥，即可获得负载丹参iia的peg-plga-peg纳米粒。

步骤（1）中加入处方剂量的丹参酮iia的量为1mg/ml～20mg/ml，所用的混合有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯，无水乙醇中任意两种混合，混合的比例为1:1～1:20，加入的peg-plga-peg的量为0.5mg/ml～50mg/ml。

步骤（3）中初乳与外水相的比例为1：1～1:30，滴加的速度为10～30滴/每分钟，搅拌的速度为100r/min～700r/min。

所述的一种包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备方法中，超声的功率为100w～500w，超声的方式为超声2s～60s间歇10s～30s，连续超声5～40min。

所述的一种包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备方法中，搅拌挥发有机溶剂的时间为4～6h，所用高速离心的转速为10000r/min～16000r/min,离心时间为20min～60min。

本发明的优点是：

1．本发明制备的包载丹参酮iia，采用的载体材料二嵌段共聚物peg-plga-peg，是一种毒性低、成本低、生物降解性较好的高分子材料，共聚物中的plga在人体内降解时,降解产物可参与新陈代谢,并最终形成二氧化碳(co2)和水(h2o),不会在体内聚集。因此，生物相容性好，无免疫原性，安全性高；

2．载体材料中plga中羟基乙酸（ga）和乳酸(la)的比例为1/100～99/100，降解能力达到最佳能够缓慢降解，控制药物缓慢释放，能充分发挥丹参酮iia的药理作用；peg亲水基团能够减少血液对纳米粒的调理作用，从而延长药物的血液半衰期；且不使用辅助溶剂，可以避免对其他正常组织器官产生副作用，给药方便，增加患者适应性；

3．peg-plga-peg为两亲性聚合物，其组成的纳米粒经过冷冻干燥后可以有效的溶于水溶液，其内部疏水性区域可以为丹参酮iia提供空间，提高丹参酮iia的溶解性，改变其在体内的分布，提高生物利用度。

附图说明

图1为实施例1制备得到的丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒扫描电镜图。

图2为实施例1制备得到的丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒粒度分布图。

图3为丹参酮iia的高效液相色谱图。

图4为实施例1制备得到的丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒体外释放曲线。

图5为实施例1制备得到的丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒组和临床丹参酮iia注射剂组的血药浓度-时间曲线。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备

（1）将2mg丹参酮iia和30mgpeg-plga-peg超声溶解在2ml丙酮和二氯甲烷（丙酮：二氯甲烷=1:9）的混合溶剂中作为油相，配制质量分数为0.5%的泊洛沙姆f188溶液作为水相；

（2）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（1）中的内水相30μl以10~30滴/每分钟速度滴加到有机相中，超声5s间歇5s，连续超声10min形成初乳；

（3）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（2）中的初乳，采用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分钟速度滴加到20ml0.5%泊洛沙姆f188溶液中（初乳复乳比为1:10），超声5s间歇5s，连续超声20min形成复乳；

（4）室温下搅拌5h，除去复乳中的有机溶剂，15000r/min高速离心30min，倒掉上清液，用去离子水反复清洗超声分散即可获得载丹参酮的纳米混悬溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除去未包裹的药物，冷冻干燥，即可获得负载丹参酮iia的peg-plga-peg纳米粒，测得纳米粒的平均粒径为158nm，包封率为90%，载药量为35%。

实施例2包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备

（1）将4mg丹参酮iia和30mgpeg-plga-peg超声溶解在2ml丙酮和二氯甲烷（丙酮：二氯甲烷=1:8）的混合溶剂中作为油相，配制质量分数为0.5%的吐温-80溶液作为水相；

（2）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（1）中的内水相30μl以10~30滴/每分钟速度滴加到有机相中，超声5s间歇5s，连续超声10min形成初乳；

（3）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（2）中的初乳，采用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分钟速度滴加到20ml0.5%吐温-80溶液中，超声5s间歇5s，连续超声20min形成复乳；

（4）室温下搅拌5h，除去复乳中的有机溶剂，15000r/min高速离心30min，倒掉上清液，用去离子水反复清洗超声分散即可获得载丹参酮的纳米混悬溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除去未包裹的药物，冷冻干燥，即可获得负载丹参酮iia的peg-plga-peg纳米粒。测得平均粒径为180nm，载药量为27%，包封率为81%。

实施例3包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备

（1）将8mg丹参酮iia和30mgpeg-plga-peg超声溶解在2ml丙酮和二氯甲烷（丙酮：二氯甲烷=1:8）的混合溶剂中作为油相，配制质量分数为0.5%的pva溶液作为内水相；

（2）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（1）中30μl的内水相以10~30滴/每分钟速度滴加到有机相中，超声5s间歇5s，连续超声10min形成初乳；

（3）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（2）中的初乳，采用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分钟速度滴加到20ml0.5%pva溶液中（初乳复乳比为1:10），超声5s间歇5s，连续超声20min形成复乳；

（4）室温下搅拌5h，除去复乳中的有机溶剂，15000r/min高速离心30min，倒掉上清液，用去离子水反复清洗超声分散即可获得载丹参酮的纳米混悬溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除去未包裹的药物，冷冻干燥，即可获得负载丹参酮iia的peg-plga-peg纳米粒，测得纳米粒的平均粒径为210nm，载药量为17%，包封率为74%。

实施例4包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备

（1）将8mg丹参酮iia和40mgpeg-plga-peg超声溶解在2ml乙酸乙酯和二氯甲烷（乙酸乙酯：二氯甲烷=1:8）的混合溶剂中作为油相，配制质量分数为1%的pva溶液作为水相；

（2）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（1）中的内水相30μl以10~30滴/每分钟速度滴加到有机相中，超声5s间歇5s，连续超声10min形成初乳；

（3）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（2）中的初乳，采用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分钟速度滴加到30ml%的pva溶液中（初乳复乳比为1:20），超声5s间歇5s，连续超声20min形成复乳；

（4）室温下搅拌5h，除去复乳中的有机溶剂，15000r/min高速离心30min，倒掉上清液，用去离子水反复清洗超声分散即可获得载丹参酮的纳米混悬溶液，用0.45um微孔滤膜过滤除去未包裹的药物，冷冻干燥，即可获得负载丹参酮iia的peg-plga-peg纳米粒，测得纳米粒的平均粒径为240nm，载药量为12%，包封率为61%。

实施例5包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备

（1）将2mg丹参酮iia和20mgpeg-plga-peg超声溶解在2ml无水乙醇和二氯甲烷（无水乙醇：二氯甲烷=1:10）的混合溶剂中作为油相，配制质量分数为1.0%的吐温-80溶液作为水相；

（2）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（1）中的内水相30μl以10~30滴/每分钟速度滴加到有机相中，超声5s间歇5s，连续超声10min形成初乳；

（3）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（2）中的初乳，采用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分钟速度滴加到1.0%的吐温-80溶液中（初乳复乳比为1:5），超声5s间歇5s，连续超声20min形成复乳；

（4）室温下搅拌5h，除去复乳中的有机溶剂，15000r/min高速离心30min，倒掉上清液，用去离子水反复清洗超声分散即可获得载丹参酮的纳米混悬溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除去未包裹的药物，冷冻干燥，即可获得负载丹参酮iia的peg-plga-peg纳米粒将，测得纳米粒的平均粒径为196nm，载药量为20%，包封率为71%。

实施例6包载丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的制备

（1）将10mg丹参酮iia和60mgpeg-plga-peg超声溶解在2ml丙酮和二氯甲烷（丙酮：二氯甲烷=1:5）的混合溶剂中作为油相，配制质量分数为1.5%的吐温-80溶液作为水相；

（2）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（1）中的内水相30μl以10~30滴/每分钟速度滴加到有机相中，超声5s间歇5s，连续超声10min形成初乳；

（3）在冰水浴搅拌的条件下，用注射器吸取步骤（2）中的初乳，采用液面下滴加的方式，以10~30滴/每分钟速度滴加到40ml1.5%的吐温-80溶液中（初乳复乳比为1:20），超声5s间歇5s，连续超声20min形成复乳；

（4）室温下搅拌5h，除去复乳中的有机溶剂，15000r/min高速离心30min，倒掉上清液，用去离子水反复清洗超声分散即可获得载丹参酮的纳米混悬溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除去未包裹的药物，冷冻干燥，即可获得负载丹参酮iia的peg-plga-peg纳米粒将，测得平均粒径为260nm，载药量为10%，包封率为53%。

实施例7丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒的载药量及包封率的测定

采用高效液相色谱测定丹参酮iia的含量:色谱柱：watersc18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇：水=75:25（v/v）柱温：25℃流速：1.0ml/min紫外检测波长：268～270nm，进样量：20μl；

分别取浓度为1、5、10.0、25.0、50、80、100μg/ml的丹参酮iia标准品溶液，按照色谱条件进行测试，以峰面积对丹参酮iia浓度进行拟合，建立回归方程。精密称取冻干好的2mg丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒，置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释后摇匀定容。0.22μm微孔滤膜过滤后，进样3次每次20μl。用hplc检测，测定峰面积，根据标准曲线回归方程，计算丹参酮iia的含量。根据以下公式，可以求得载药量和包封率(丹参酮iia高效液相色谱图如图3所示)，包封率%=（纳米载体中所含的药量/投入的总药量）×100%，载药量%=（纳米载体中所含的药量/投入的总药量）×100%。

实施例8:丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒外观形态、zate电位、粒径大小和分布的测定。

实施例9:使用扫描电子显微镜观察纳米粒(实施例2制备)的外观形态，如图1所示，采用激光粒度分析仪可测定纳米粒的粒径分布及zeta电位，如图2所示。

实施例10丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒体外释药的测定。

精密称量丹参酮iia原料药和冷冻干燥后的丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒各8mg，分别置于5ml0.01mol/l的ph=7.4pbs缓冲液中，再放入50ml的离心管，立即置于37±1℃恒温水浴摇床中，100r/min匀速搅拌，并保持漏槽条件。分别于0、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h规定的时间点取样1ml，同时补充等量等温的新鲜介质。样品经15000r/min离心25min后，取出上清液用0.22μm微孔滤膜过滤后，加一倍量的甲醇稀释后进样20μl，记录峰面积，代入标准曲线，计算溶液中丹参酮iia的浓度液，计算规定时间内的药物累计释放率。每个样品平行操作3份，以累积释放率的平均值对时间绘制体外累计释放曲线（如图4所示）。

实施例11:丹参酮iiapeg-plga-peg纳米粒大鼠体内药动学性质考察。

使用健康雄性sd大鼠，随机分为两组（n=10），每组5只，空白丹参酮iia（10mg/kg）混悬在羧甲基纤维素钠溶液中，peg-plga-peg纳米粒(含有tiia10mg/kg，实施例1制备)分散于生理盐水中，分别通过尾静脉注射，分别于给药后（0,5,15,30和45分钟;1,2,4,6,8,12、24和36小时），通过尾静脉收集血样（0.5ml），4000r/min离心l0min，取上清(血清)200μl,加入500μl甲醇，涡旋3min,7000r/min离心l0min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，使用高效液相法测定滤液中丹参酮iia的浓度，计算血液中丹参酮iia的浓度，绘制peg-plga-peg纳米粒组和临床丹参酮iia注射剂组血药浓度一时间曲线(如图5所示)。