文献精读

原创 李居宸 山中麻署

类淋巴系统的解剖基础是血管旁间隙（perivascular spaces）。在软脑膜处，该间隙内充满了液体；在脑实质内，该间隙内则填充着由周细胞（pericytes）和纤维母细胞分泌的富含IV型胶原和层粘连蛋白的细胞外基质。其中，周细胞在血脑屏障（BBB）和血管旁间隙的形成中发挥重要作用，因此本研究假设促进周细胞和血管平滑肌细胞发育的关键信号通路——血小板源性生长因子B（PDGF-B）通路，同样也是类淋巴系统形成的关键通路，并进一步详细描述了类淋巴系统形成的时间节点及其机制。

1、类淋巴系统在胚胎17.5天尚未形成

作者通过将CSF示踪剂FITC（3 kDa）和OA-647（45 kDa）子宫内注射至胚胎17.5天（BBB已形成）小鼠枕大池，观察示踪剂的分布以评估类淋巴系统功能。结果显示在胚胎期大脑中，示踪剂以类似于扩散的形式进行分布，并且在注射位点附近的区域（主要是中脑和后脑）的荧光强度最强（图1B-C）。此外，作者未观察到CSF示踪剂在整个胚胎皮层内有所分布（图1B），在离体的全脑成像中观察到45 kDa OA-647示踪剂可沿Willis环后交通动脉处部分蓄积（图1C）。

2、小鼠不同发育阶段呈现不同的局部CSF流动模式

随后作者通过对出生后的小鼠枕大池内注射CSF示踪剂，进一步评估了小鼠年龄相关的脑内CSF流动情况。

出生后1天（P1）小鼠的大脑腹侧观显示，大分子量示踪剂（45 kDa OA）沿着后交通动脉、大脑中动脉（MCAs）和大脑前动脉分布到嗅球尾部的梨状皮层（图S1）。而小分量示踪剂（3 kDa FITC）可能由于直接扩散到了未成熟的脑组织内（细胞外空间高达36%-46%），因此仅观察到有少量沿血管旁分布。沿血管旁流动的CSF示踪剂在MCAs第一个分支前即停止流动，因而在背侧皮层并未观察到示踪剂（图1D）。有趣的是，新生鼠海马是唯一可以观察到的示踪剂深入脑实质的区域（图1D、E、H）。

P7小鼠的大脑腹侧观显示，沿血管旁流动的CSF示踪剂沿着基底动脉和Willis环到达了大脑中动脉（图S1）。冠状脑片结果则提示，从梨状叶到岛叶再到新皮层，内流至脑实质内的示踪剂呈梯度变化，即在梨状皮层示踪剂荧光强度最高，在大部分新背侧皮层荧光强度最低（图1D、F）。此外，作为CSF主要排出路径，嗅球处具有较强的CSF示踪剂荧光强度（图1D）。总的来说，对于出生后1周的小鼠，与成年小鼠类似，除了新皮层背侧部，在海马区、梨状皮层和嗅球处均有示踪剂的分布（图1D、F）。并且海马区的示踪剂在各年龄段均有较强的荧光强度（图1E、I）。此外，对于P14小鼠来说，沿血管旁流动的示踪剂分布在大脑多个区域，包括背侧皮层和丘脑，分布模式同成年小鼠类似（图1D、G、J）。

在对CSF示踪剂定量化分析中发现，在新生鼠中，海马处的CSF示踪剂荧光强度是皮层的2倍（图1K、L）。在P7、P14和成年小鼠中，和皮层相比，海马、丘脑、纹状体中的CSF示踪剂荧光强度没有明显差异。

3、出生后CSF示踪剂流动模式的变化

作者通过枕大池内注射示踪剂，经颅骨成像，进一步描述了CSF示踪剂沿血管旁流动的动力学情况。

对P1小鼠在体成像观察到，示踪剂缓慢地流入后脑，而皮层和嗅球处几乎没有示踪剂流入（图2A、B）。在P7小鼠中，示踪剂仍然主要分布在后脑、中脑和小脑，而在示踪剂注射60min后皮层和嗅球出也可见少量示踪剂流入（图2C、D）。与P1小鼠相比，P7小鼠的示踪剂可沿MCAs血管旁间隙由腹侧向背侧转移（图2A、B）。与P7小鼠不同，P14小鼠的示踪剂沿MCAs血管旁间隙的流动更加迅猛。在P14小鼠中，CSF示踪剂的平均荧光强度在皮层、小脑和嗅球处有着相似的上升趋势（图2C、D）。成年小鼠则与P14小鼠有着同样的示踪剂运动轨迹：即沿着MCAs血管旁隙快速流入新皮层，并且在皮层、小脑和嗅球处有着相同的平均荧光强度（图2A-D）。这些观察结果提示，尽管对于P7小鼠来说，此时时已经存在了沿血管旁路径，但此时其功能仍不完善。相反，P14小鼠的CSF示踪剂分布与成年小鼠基本一致（图2C、D）。

值得注意的是，在体和脑片成像之所以均显示CSF示踪剂总能出现在嗅球处并有着较强的荧光强度（图1、2），是因为该区域连接着颅神经和鼻腔淋巴流出道，脑脊液可通过此路径出颅。

4、类淋巴系统的形成依赖于星形胶质细胞

血管侧的“终足”和AQP4极性的形成

成年大脑内，AQP4蛋白主要分布在星形胶质细胞“终足”的质膜上，这种现象称之为AQP4极性。AQP4蛋白表达减少或者极性消失均可减弱类淋巴系统的功能。为了明确小鼠出生后不久CSF即可流入海马区域的机制，作者进一步分析了小鼠发育过程中AQP4蛋白的亚细胞定位。

作者通过“终足”上的AQP4蛋白免疫荧光信号与皮层和海马处的脑实质内AQP4蛋白信号的比值来分析AQP4极性的情况。与P7、P14和成年小鼠不同，在P1小鼠中，AQP4蛋白弥散分布于整个皮质，而不是局限于血管旁（图3A）。对于P1小鼠，相比于皮层，AQP4蛋白在海马的腔隙层和分子层处的极性更加明显（图3A-C），这与P1小鼠中血管旁示踪剂局限于海马有关（图1E、H）。同样地，P7小鼠的海马处AQP4极性水平比皮层处更高。而在P14小鼠中，其海马和皮层处的AQP4极性相似。到了成年小鼠，其皮层处的AQP4极性水平反而比海马处更高（图3A-C）。

随后，作者使用GLT1-eGFP星形胶质细胞标记小鼠评估血管旁间隙形成的情况。在P1幼鼠的皮层中，沿凝集素染色的血管旁几乎没有eGFP+细胞。尽管存在部分eGFP+突起与血管交互，但此时星形胶质细胞呈圆形，突起较少，且无终足形态（图3D）。清晰的沿血管分布的连续的GLT1-eGFP+星形胶质细胞最早出现在P7小鼠中，并且在P14和成年小鼠中变得更加明显。

为了进一步确认在整个发育过程中AQP4极性情况，作者使用Western Blotting方法测量了脑血管旁和脑实质内的AQP4含量。在不同发育阶段脑实质内的AQP4蛋白含量始终保持这较低水平（图3E-H，S2A-D）。在皮层，血管旁AQP4极性在P14期建立并持续至成年（图3E、F，S2A-B）。在P14和成年小鼠海马区，血管旁AQP4含量同样高于脑实质内AQP4含量（图3G、H，S2C、D）。

最后，作者分析了局部脑区AQP4表达水平并比较了其CSF示踪剂分布情况。在P1小鼠中，海马的腔隙层和分子层区域呈现最高水平的AQP4表达（图4A、B）。并且AQP4免疫荧光信号在海马伞部和背外侧丘脑核同样强烈，反映了示踪剂在P1期的分布（图4C、D）。AQP4免疫荧光强度在腹侧脑的软脑膜表面最高，其次在丘脑、下丘脑和梨状皮层，而在新皮层则可以忽略不计（图4A）。

对于P7小鼠来说，其大脑背侧皮层的AQP4表达水平与腹侧相同，但海马、嗅球、脑干、小脑处的AQP4免疫荧光信号更高（图4E-G）。AQP4的表达与海马和嗅球处的示踪剂分布有关（图1，4H-J）。在小脑，AQP4的表达则集中在白质和浦肯野细胞层（图4G），同样和示踪剂在此区域的分布相关（图4J）。

在成年小鼠中，与P7小鼠相比，AQP4的表达出现了激增（图4K），而且这种增长与成年小鼠大脑CSF沿血管旁内流更加活跃有关。在嗅球和小脑处的AQP4呈异常高表达（图4L、M）。示踪剂在嗅球的分布与AQP4高表达一致（图4O），这与筛板是脑脊液的主要出口通道相吻合。从P7期到成年期小鼠小脑中AQP4表达的变化主要表现为分子层表达的增加（图4G、M），这与文献报道一致。

综上所述，AQP4的表达发育谱呈由大脑腹侧向背侧逐步发育，示踪剂沿类淋巴系统中的流动也是如此，而海马部位较早出现的AQP4极化与CSF示踪剂在小鼠发育早期即可大量出现在实质的现象相一致。

5、PDGF-B缺陷小鼠的血管旁溶质转运受抑制

鉴于周细胞通过PDGF-B信号通路在BBB和血管旁间隙的形成中发挥着重要作用，因此作者使用了PDGF-B敲除（Pdgfb ret/ret）小鼠（该小鼠的PDGF-B信号减弱、周细胞数量减少）进一步观察了CSF示踪剂的血管旁转运情况。

和野生型（WT）小鼠相比，Pdgfb ret/ret小鼠软脑膜动脉旁间隙的CSF示踪剂流动出现严重延迟和不全（图5A、B）。令人惊讶的是，示踪剂的流动在Pdgfb ret/+小鼠中也同样受到抑制，但其抑制程度低于Pdgfb ret/ret小鼠（图5A、B）。随后作者使用front-tracking分析法进一步分析了血管旁CSF流动速度，与WT小鼠相比，Pdgfb ret/ret小鼠CSF示踪剂的移动明显减慢（图5C、D）。

随后作者又评估了Pdgfb ret小鼠出生后45 kDa OA和3 kDa FITC示踪剂的分布情况。PDGF-B的减少可导致这两种示踪剂在P1期Pdgfb ret/+小鼠的海马区的内流减少（图5E-J）。与P1期Pdgfb ret/+小鼠相比，P7期小鼠海马区的示踪剂内流较高，类似于在较不成熟阶段的WT小鼠中观察到现象（图5 K-P）。在P14期，当WT小鼠皮层的示踪剂内流增加时，Pdgfbret/+小鼠皮层中45 kDa OA - 647内流则显著减少（图5Q-V）。与WT小鼠相比，成年Pdgfb ret/ret和Pdgfb ret/+小鼠的脑切片成像提示其脑实质内CSF示踪剂有所减少（图5W、X）。与在体成像和front-tracking分析法的结果一致（图5A-E），同WT小鼠相比，成年Pdgfbret/re小鼠皮层中CSF示踪剂OA-647（45 kDa）与FITC-dextran (3 kDa)的平均荧光强度及示踪剂渗透比例有所减少（图5Y-AB），这进一步说明PDGF-B在皮层类淋巴系统的发育中至关重要。

6、PDGF-B信号的减少造导致周细胞缺乏和AQP4移位

PDGF-B是周细胞发育的重要生长因子。因此，作者定量比较了Pdgfb ret/+和Pdgfb ret/ret小鼠的周细胞密度。结果显示，成年Pdgfb ret/ret小鼠皮层周细胞密度减少了91.5%±2.0%，而Pdgfb ret/+小鼠周细胞密度则下降了66.0%±6.8%（图6A、B）。这一结果说明了Pdgfb ret/+小鼠的PDGF-B和周细胞功能同样处于异常状态，而PDGF-B和周细胞的正常功能则需要野生型纯合子基因。有趣的是，在Pdgfb ret/ret小鼠而非Pdgfb ret/+小鼠中，有62.5%±13.9%的周细胞胞体与AQP4阳性的血管分支缺乏密切的空间关系（图6C）。在Pdgfb ret/+和Pdgfb ret/ret小鼠皮层中，AQP4平均染色强度分别降低了42.5%±4.5%和36.5%±4.9%（图6D）。同样地，在Pdgfb ret/+和Pdgfb ret/ret小鼠海马中也发现了类似的周细胞密度、周细胞与血管的关系以及AQP4免疫荧光信号的下降（图6E-H）。

周细胞可表达层粘连蛋白α2和聚集蛋白，帮助AQP4锚定在星形胶质细胞的“终足”上。因此，作者进一步研究了Pdgfb ret小鼠的AQP4极性情况在。在Pdgfb ret/+和Pdgfb ret/ret小鼠皮层中，AQP4极性和极性指数分别降低了18.3%±2.8%和37.6%±3.5%，而两种小鼠在海马区的AQP4极性分别下降了17.4%±3.7%（Pdgfb ret/ret）和33.8%±3.3%（Pdgfb ret/+）（图6I-N）。

随后作者使用western blotting进一步评估了AQP4蛋白在脑血管旁和脑实质内的表达情况。结果显示，与WT小鼠相比，在杂合子和纯合子Pdgfbret小鼠中，脑实质内AQP4含量并没有差异（图6O-Q，S3B）。然而，在WT和Pdgfb ret/wt小鼠而非Pdgfb ret/ret小鼠的皮层和海马中，和脑实质相比，血管旁的AQP4蛋白表达明显增高，这表明当PDGF-B信号减弱时，AQP4极性也随之减弱（图6O-Q）。

总结

类淋巴系统通过全脑血管旁间隙网络系统促进了脑脊液和组织液交换，排出脑组织内代谢废物并维持其内环境稳定，在神经退行性疾病、脑卒中、脑损伤等病理生理过程中发挥重要作用。该研究详细地描述了小鼠类淋巴系统早期发育形成的过程。血管旁的脑脊液转运最早发生在新生鼠海马区，直到小鼠出生2周，成熟的类淋巴系统才完全建立起来。其中星形胶质细胞“终足”和AQP4极性的形成与血管旁脑脊液转运的出现密切相关。此外，维持周细胞正常功能的重要信号通路——PDGF-B信号通路的抑制可减弱AQP4极性的形成并进一步影响类淋巴系统的成熟。这一研究结果不仅清晰地阐明了类淋巴系统发育形成的生理过程以及周细胞、星形胶质细胞在其中的重要作用，同时也为深刻认识年龄、神经相关疾病等病理生理过程是如何影响类淋巴系统提供了新的视角和思路。

原始文献：

Munk AS, Wang W, Bèchet NB, et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Rep. 2019;26(11):2955-2969.e3. doi:10.1016/j.celrep.2019.02.050

作 者：

李居宸

排 版：

蒋 明

校 审：

方 芳

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缪长虹

原标题：《文献精读 | PDGF-B：类淋巴系统形成必备》

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