聚合酶链反应 PCR

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是 Kary Mullis 在 20 世纪 80 年代开发的用以快速扩增特定 DNA 片段的革命性方法。PCR 的基础是利用 DNA 聚合酶合成与所提供的模板链互补的新 DNA 链。因为 DNA 聚合酶只能将核苷酸添加到先前存在的 3'-OH 基团上，所以 PCR 反应需要一个带有3'-OH 基团的引物。引物的使用，同时也让有针对性地扩增特定区段成为了可能。在 PCR 反应结束时，特定序列将累积成数十亿个拷贝（扩增子 amplicons）。

PCR 利用温度循环启动和结束酶催化 DNA 的合成，包含 3 个步骤：

PCR 在热循环仪中进行。最初的两个循环，产生长度与目标片段 DNA （两引物之间，包含两引物）相等的扩增片段。之后的每个循环，目标片段的数量均加倍，目标片段数量呈指数形式增长，直至引物或寡核苷酸缺乏。

[!Ct] Ct 值被定义为在基线上方首次检测到荧光信号的循环次数，与目标序列初始拷贝数的 log10 负相关。在大多数商用机器中，Ct 值被设定为信号比平均基线信号高 10 倍时的循环数。

在 PCR 反应因为原料缺失或产物抑制等原因达到终点时，在两种表示方法上都会形成一条与 \(x\) 轴平行的线。在 产物量（荧光强度）-循环数图中，不同的反应终点有显著的不同。但在 log10 产物量-循环数图中，不同反应最终达到同一个平台，因为用对数表示的情况下产物量差距不大。

[!Note] 合成的引物 5' 没有磷酸基团。

引物设计步骤：

引物设计原则：

在 74˚C 下，一个酶活力单位 U 的 Taq DNA 聚合酶在 30 分钟内将 10 nmol 的 dNTP 掺入。尽管 Taq 聚合酶仍然是常规扩增 DNA 小片段的首选酶，但它缺乏 3'->5' 校对功能，并且错误掺入率高（9000 个核苷酸中的一个核苷酸）。从其他嗜热细菌和古细菌中分离出来的耐热 DNA 聚合酶，例如 Pfu DNA 聚合酶，具有校对活性。可以在需要更高保真度时代替 Taq（或与 Taq 结合使用），当目标扩增子的长度超过几千个碱基，或者在通过逆转录 PCR (RT-PCR) 克隆 mRNA 时。

核苷酸（dNTPs 或脱氧核苷酸三磷酸）：碱基A、T、G和C的单个单元，是新DNA链的“构建块”。标准 PCR 包含等摩尔量的 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP。

核苷酸加入的量需根据具体反应条件来确定。例如，在使用 Taq 酶，1.5 mM 的 \(MgCl_2\) 条件下，每一种 dNTP 的含量在 200-250 μM。

高浓度的 dNTP (>4 mM) 能够抑制 PCR 反应，可能是由于 dNTP 的磷酸基团螯合 \(Mg^{2+}\) 使其浓度下降的原因。

dNTPs 储液对冻融敏感，经过几次冻融循环后，PCR 的效率开始下降。为避免此情况出现，应将 100-200 mM 的 dNTPs 储液分成 2-5 μL 的小份（含 10 mM Tris pH 8.0），并在两次冻融后丢弃。如果不加入缓冲液，可能会使 dNTPs 发生酸水解。

DNA 聚合酶发挥作用需要二价金属离子的辅助。

2 个二价的金属阳离子，结合在 DNA 聚合酶由 β 折叠片构成的手掌域催化位点附近，改变正确碱基配对的 dNTP 和引物 3'-OH 周围的化学环境。第一个金属离子降低 3'-OH 对氢的亲和力，产生一个准备对引入 dNTP 上 α-磷酸进行亲和攻击的 3'-\(O^-\). 第二个金属离子与 dNTP 的 β- 和 γ-磷酸负电荷协同作用，稳定由连接反应之后产生的焦磷酸。

PCR 反应中常用的二价离子为镁 \(Mg^{2+}\) 离子，有些缓冲液也使用锰 \(Mn^{2+}\) 离子，钙 \(Ca^{2+}\) 离子作用效率最低。

镁离子在 PCR 反应中的作用

镁离子的用量：超出引物+模板的磷酸基团量（一般采用 1.5 mM）

PCR 反应体系中不应存在螯合剂，如乙二胺四乙酸、\(PO_4^{3-}\)，以使 \(Mg^{2+}\) 正常发挥作用。

[!Caution] 反复冻融氯化镁溶液会使之分层，使用前需完全混匀。

KCl 在 PCR 中主要起到中和 DNA 骨架上负电荷的作用。能增加引物与模板配对的稳定性。

标准 PCR 缓冲液含有 50 mM KCl，适用于扩增长度大于 500 bp 的 DNA 片段。将 KCl 浓度提高到 70-100 mM 通常会提高较短 DNA 片段的产量。

Tris-HCl 目的是让 72 摄氏度附近的 pH ~7.2。所以加入室温 pH 8.3-8.8 的缓冲液

在调整 \(Mg^{2+}\) 、\(K^+\) 浓度仍然不能提高 PCR 效率或特异性时，可以考虑以下添加剂。

基本聚合酶链式反应 (PCR) 已适用于分子克隆中的各种任务，包括 DNA 测序、体外诱变、突变检测、克隆 cDNA 和基因组 DNA 以及等位基因。

阳性对照用来监测 PCR 的效率，阴性对照用来检测含有目标序列的 DNA 的污染。

目标 DNA（Target DNA）：包含目标序列。它可以是重组 DNA 克隆、纯化的 DNA 片段或基因组 DNA 样本。它应该以与模板 DNA 中预期的浓度相当的浓度添加到阳性对照中。通常需要准备一系列包含不同数量的目标 DNA 的阳性对照，浓度跨越模板 DNA 中预测的数量。

当通过琼脂糖凝胶电泳分析产物时，理想情况下应仅存在 1 条带，若多条带同时存在，则采用如下方法：

若上述两种方法均不奏效，将所有条带从胶上回收，采用 TA 克隆分别进行克隆。

纯化 PCR 产物主要是除去体系中的 dNTP、单链 DNA、引物、DNA 聚合酶。除了使用酚氯仿法 PCl 等传统方法，纯化 DNA 的试剂盒有几种类型：

标准聚合酶链式反应 (PCR) 用于扩增位于两个内向引物之间的 DNA 片段。相比之下，反向 PCR Inverse PCR（也称为 inverted or inside-out PCR） 用于扩增位于已知 DNA 序列一端没有可用引物的未知 DNA 序列。

反向 PCR 广泛用于快速等位基因分析和确定逆转录病毒、转基因和转座子集成到基因组中的位置。它是一个耗时且繁琐的过程。与常规 PCR 相比，限制性消化和连接测定需要更多时间。该技术依赖于如此多的酶促步骤，因此反应失败的可能性很高。整个实验的成本高于传统的PCR。

在哺乳动物的基因组中，通常存在着许多具有特征的序列。这些特征包括：单核苷酸卫星序列、反向重复序列、GC-富集的区段。在基因组 PCR 时，这些具有特征的序列往往会形成二级结构，不能很好地解链。同时，被阻碍的 DNA 聚合酶会产生许多短的、不正确的扩增产物，这些产物在之后的循环中也会被放大。这些问题最终都会导致 PCR 失败。

有时候，更改引物设计，更改循环方案，或使用 Hot Start PCR、 Touchdown PCR 的组合能够解决问题。更常见的，是使用多管齐下的方法，例如在扩增反应中使用增强剂、调整循环方案，以及在必要时设计新的引物组。

引物设计

在设计用于扩增富含 GC 的序列的引物时，使用寡核苷酸设计程序检查：

添加剂

大多数情况下，多种添加剂混合使用的成功率比单一添加剂高。

Additive Solution (5x)

循环条件

将升温 (2.5 ˚C/sec) 和降温 (1.5 ˚C/sec) 速度减慢是应对 GC-含量高的目标序列的一种方法。

标准 PCR 反应对小于 ~3kb 的目标 DNA 序列的扩增十分有效，但对于更长的区段，则会产生不同长度的截短产物，在凝胶上显示出涂抹 smear 现象。Long and Accurate PCR (LA PCR) 采用两种不同 DNA 聚合酶的混合来进行 PCR 反应。

商用 DNA 聚合酶产品：

LA PCR 中的模板 DNA 最好溶于 TENB buffer。

长片段 DNA 扩增失败的原因：

对 LA PCR 的进一步改进：

嵌套聚合酶链式反应 Nested PCR 用于需要增加 PCR 的敏感性和/或特异性的情况，例如：

嵌套 PCR 通常涉及两个连续的扩增反应，每个反应使用不同的引物对。第一次扩增反应的产物用作第二次 PCR 的模板，第二次 PCR 由位于第一引物对内部的寡核苷酸引发。使用两对寡核苷酸可以进行更多的循环，从而提高 PCR 的灵敏度。反应特异性的提升，源于使用两组不同的引物与同一目标模板的结合。嵌套 PCR 也是一种，在了解目标序列的前提下，扩增长模板片段的有效方法。

在嵌套 PCR 中，引物分别叫做 Outer Oligonucleotide 和 Inner Oligonucleotide.

还有一种半嵌套 PCR（semi-nested PCR） 其中的一条 Inner Oligonucleotide 与一条 Outer Oligonucleotide 相同。半嵌套 PCR 的特异性没有嵌套 PCR 高。

菌落 PCR 是一种用于在转化步骤后快速筛选在选择性培养基上生长的酵母菌或细菌菌落的方法，以验证所需的基因构建体是否存在，或扩增构建体的一部分。聚合酶链式反应 (PCR)，而不是更费力的小量制备，通常用于筛选大肠杆菌菌落中包含感兴趣序列的重组质粒。当筛选通过 PCR 扩增的 DNA 片段的菌落时，可以使用与扩增反应相同的引物进行筛选。为了探明克隆片段的方向，可以使用第三个引物，它与紧邻插入位点的质粒序列结合并指向插入物。

由于 PCR 反应体系在室温下配制，容易得到非特异性的扩增产物，热启动 PCR Hot Start Polymerase Chain Reaction 是一种减少此种产物的常用技术。在室温下，PCR 引物可以与不完全互补的模板序列退火。由于热稳定的 DNA 聚合酶在这些低温下具有部分活性，因此聚合酶可以延伸错误退火的引物。然后这个新合成的非特异性区域作为模板，延伸和合成非特异性的扩增产物。

热启动 PCR Hot Start Polymerase Chain Reaction 还可以减少引物二聚体的形成。在较低温度下，PCR 引物可以通过互补区域相互退火，DNA 聚合酶可以延伸退火的引物以产生引物二聚体，在溴化乙锭染色的凝胶上通常显示为大约 50-100 bp 的扩散带。

为了使 PCR 反应在加热到特定温度之前不会进行，通常有几种方法：

对于许多研究人员来说，降落 PCR，touchdown PCR 绕过了为每对引物确定最佳退火温度的需要，并用于在常规 PCR 中获得可接受的扩增产物产量。当目标序列与引物序列可能不匹配时（例如从氨基酸序列推导引物序列），降落 PCR 是绝佳的选择。

在 PCR 反应中，非特异性的配对能导致目标序列之外的序列被扩增，在温度低的时候尤为明显。产生的错误扩增产物在之后的循环中被指数放大。

在 touchdown PCR 中，选择的退火温度比解链温度 Tm 高 5-10 °C。因此，引物只能与它们的特异性和互补序列结合。每次循环后，温度降低 1 °C，最终达到低于解链温度 2-5 ℃。然后，PCR 循环的退火温度在最低退火温度保持 12-27 个循环。即使由于较高的温度，目标 DNA 区段在初始循环中没有被扩增，它也会在后续循环中被扩增。在较高温度获得的正确目标片段在之后的循环中被大量扩增，由于序列的富集呈指数形式，所以正确的片段在产物中占绝大多数。

多重 PCR (Multiplex PCR) 用于在单个 PCR 实验中扩增多个靶标，可以通过在反应混合物中使用多个引物对来扩增多个目标序列。其最初被用来筛选人类基因组 Duchenne 肌营养不良基因座的不同突变。作为 PCR 实际应用的延伸，该技术有可能在不影响实验效用的情况下，在实验室内节省大量时间和精力。

多重 PCR 有两种类型：

多重 PCR 的引物设计有如下特点：

Relay-PCR是一种新的、简单且稳健的多重 PCR 方法。一次 PCR 运行完成两个功能独立的反应阶段，无需任何引物去除步骤，从而显着简化了一步工作流程。将一对普通引物和多对特异性引物的混合物添加到单个试管中的基因组 DNA 样品中。捕获感兴趣的基因组靶标的选择阶段和文库扩增阶段都将在这个单一的 PCR 反应期间发生。

更重要的是，通过将特定引物的作用限制在仅用于目标复制的前两个热循环中，并允许在剩余的热循环中自动切换到用于文库扩增的通用引物。这种安排消除了由于特定引物之间的引发效率变化而导致最终产物中扩增子与扩增子变化的重要原因，如果用作扩增引物，这些引物将呈指数级扩增。

Relay-PCR 使用的 omega 引物：

omega 引物由 3 个功能部分组成：

用于基本 PCR 的热稳定性 DNA 聚合酶需要 DNA 模板，因此，该技术仅限于 DNA 样本的分析。要将 PCR 应用于 RNA 研究，必须首先将 RNA 样品转化为 cDNA，以便为热稳定聚合酶提供必要的 DNA 模板。该过程称为逆转录 (reverse transcription, RT)，因此此方法被称为 RT-PCR。

进行逆转录的引物有 3 种类型，取决于实验目的：

反转录酶（reverse transcriptase, RT）：是 RNA 介导的 DNA 合成酶，最初从反转录病毒中分离。RTs 使用反转录引物、dNTPs 和 \(Mg^{2+}\) 或 \(Mn^{2+}\) 作为辅因子催化目标 RNA 分子的 DNA 拷贝 (cDNA) 的合成。

常用的逆转录酶有 3 种：

它们可以使用带有 3'-OH 的 RNA 或 DNA 为引物，RNA 或 DNA 为模板，合成 DNA。由于缺乏 3'->5' 核酸外切酶活性，两种酶都是易错的。两种酶催化反应的 Km 值均较高，为了确保 RNA 的完全逆转录，需要使用比基本 PCR 反应更高浓度的 dNTPs.

AMV 具有强大的 RNase H 活性，可以消化 RNA-DNA 杂合体的 RNA 部分，如果逆转录酶在合成过程中暂停，它可以在正在生长的 DNA 链 3' 末端附近切割模板。因此，与禽类逆转录酶相关的高水平 RNase H 活性倾向于抑制 cDNA 的产量并限制其长度。

MuLV 逆转录酶比禽类酶更适合 RT-PCR，因为它的 RNase H 活性相对较弱。然而，由于其最适温度为 37 ℃，在此温度下的 RNA 模板二级结构较 42 ℃ 下更多，所以其很容易被 RNA 模板中的二级结构阻断。

许多公司开发了 MuLV 逆转录酶的突变体。与野生型酶相比，修饰的逆转录酶转录更大比例的模板分子并合成更长的 cDNA 分子。此外，它们具有更高热稳定性（高达 60˚C），这在模板 RNA 被折叠成二级结构时是一个优势。这些被改造过的酶被广泛用于一步和两步 RT-PCR。

由嗜热细菌 Thermus thermophilus 编码，在 Mn2+ 存在下显示逆转录酶活性。在 RT-PCR 中使用 rTth 聚合酶的主要优点是反应的两个阶段（逆转录和扩增）都在同一个反应管中进行（即一步 RT-PCR）。然而，Tth DNA 聚合酶不能与 oligo(dT) 或随机六聚体一起用作引物，因为杂合体在进行逆转录的温度（60°C 和 70°C 之间）下不稳定。一些制造商出售改进的热稳定 DNA 聚合酶版本，能够有效地将 RNA 复制到 cDNA 中。这些酶主要用于一步法 RT-PCR。

RT-PCR 可以作为两个独立的反应进行，也可以作为一个需要更特异的商业酶的反应进行。一步法和两步法 RT-PCR 的区别在于：两步法是先完成反转录，反转录引物为通用引物，后以 cDNA 为模板进行后续 PCR 检测；一步法是直接以 RNA 为模板，在一个反应体系中先完成反转录，反转录引物为基因特异性引物（GSP），然后直接进行扩增，得不到cDNA。

两步法 RT-PCR

一步法 RT-PCR

Ung/dUT 系统防止非特异性 PCR 扩增和污染。

ung 和 dut 都是大肠杆菌中的基因。UNG 是大肠杆菌的一种尿嘧啶-DNA 糖基化酶 Uracil-DNA glycosylases (UDGs)，掺入 DNA 的尿嘧啶残基通常被这种酶去除，该酶切割碱基和脱氧核糖磷酸骨架之间的 N-糖苷键，产生无嘧啶位点。dUT 是脱氧尿苷三磷酸酶 deoxyuridine triphosphatase (dut)，一种含锌四聚焦磷酸酶，dUT 能将 dUTP 转化成 dUMP。

UNG 可以特异性降解已经通过 PCR 过程的产物。 UNG 允许先前的 PCR 扩增或错误引发的非特异性产物降解，使用于扩增的天然核酸模板保持完整。 UNG 激活是 PCR 的第一步，在 50°C 孵育 2 分钟。

dUTP:dTTP 比率升高导致 dUTP 在通常由胸腺嘧啶占据的位点的随机子集中错误掺入的频率增加。加入 dUT 能遏制这种现象。

RACE (rapid amplification of cDNA end)，已知部分cDNA序列，基于 mRNA 逆转录和 PCR 技术获得完整的 cDNA 的 3' 或5' 末端的分子生物学技术。

当采用 PCR 技术进行逆转录时，由寡核苷酸（dT）做引物的第一链 cDNA 的合成通常包含 RNA 的 3' 序列。但是，由序列内部特异性引物做引物合成的 cDNA 通常缺乏 mRNA 两末端的序列，且当 mRNA 含有可变剪接或内部富含 A 时，能够产生不包含 3' 的 cDNA 序列。

含有这些特征的序列能被 3′ -RACE (rapid amplifification of cDNA ends) 技术所恢复，同时，3'-RACE 技术也能被用来将具有可变多聚腺苷酸化位点的 mRNA 家族的 3' 末端比对到基因图上。

3'-RACE 的引物如下：

采用 (dT)17 adaptor–primer 将一组 mRNA 逆转录成 cDNA。逆转录后通过使用序列特异性引物转变为双链 DNA。扩增的产物被分离、用合适的限制酶切割、克隆和表征。

在一轮 PCR 结束后，还可以使用嵌套 PCR，以提高 cDNA 的丰度。

在 cDNA 建库中，缺少 5' mRNA 序列的 cDNA 序列经常出现。5'-RACE 与 3'-RACE 类似，其能在已知少部分序列的情况下，扩增 mRNA 5' 端序列。其根据已知的 cDNA 序列设计基因特异性引物，在逆转录酶的作用下，合成第一条链 cDNA，末端转移酶在 cDNA 链 3' 端加入连续的同聚核苷酸，以连有互补配对的同聚核苷酸引物和基因特异性引物进行 PCR 扩增，以期得到 mRNA 的 5' 端。

5'-RACE 流程：

5'-RACE 的引物如下：

末端转移酶：末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Tdt)，一种 510 个氨基酸的单体酶，能在没有模板的情况下，催化数百个 dNTPs 添加到 DNA 分子的 3' 末端。在分子克隆中，末端转移酶主要用于催化在 5'-RACE 和 3'-RACE 反应中产生的单链 DNA 中添加同聚尾。当面对不同的具有 3' 末端的 DNA 分子时，末端转移酶倾向于对带有未配对的 3'-DNA 加尾，其次是平末端 DNA，最后是凹陷的 3' 末端。在平末端的情况下，添加第一个核苷酸是反应的限速步骤。

末端转移酶对反应条件有不寻常的要求。它被反应缓冲液中通常包含的许多阳离子所抑制，包括铵离子、氯离子和磷酸根离子。大多数反应在甲次砷酸盐（即二甲基砷酸）缓冲液中进行，100 mM Tris-乙酸盐（pH 7.2）也可。使用 dTTP 或 dCTP 作为底物的均聚拖尾反应在 \(Co^{2+}\) 存在下进行； \(Mn^{2+}\) 是涉及嘌呤残基（A/T）聚合的均聚拖尾反应的首选辅助因子。

末端转移酶在 pre-B 和 pre-T 淋巴细胞中表达，通常用作由这些细胞引起的某些类型白血病的标志物。在免疫系统成熟期间，Tdt 通过添加不依赖模板的核苷酸和破坏同源定向重组来介导 T 细胞受体库的扩增和多样化

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