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荧光定量PCR的那些曲线，你真的看懂了吗？
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荧光定量PCR是通过检测并记录反应体系中荧光信号的变化来实时监测整个PCR进程，这就不得不来说一说荧光定量PCR中的三大曲线：扩增曲线、熔解曲线、标准曲线。 首先简单了解一下荧光定量PCR的扩增程序，以荧光染料法为例，扩增程序可分为扩增反应阶段和熔解反应阶段。  荧光定量PCR扩增程序（以SYBR GreenⅠ染料法为例）扩增反应阶段：采用两步法扩增，每一次PCR循环结束都检测并记录荧光信号，由此得到一条扩增曲线。 熔解反应阶段：PCR扩增阶段结束后，设置一段熔解反应程序，检测并记录DNA双链产物解链过程的荧光信号变化，得到一条熔解曲线。 扩增曲线扩增曲线是描述PCR动态进程的曲线，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光信号强度为纵坐标。 理论上PCR过程中反应产物是以指数增长的，但随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶失活、dNTP和引物枯竭、反应副产物阻碍反应等原因，致使PCR的扩增效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，因此扩增曲线是一条“S形”曲线。 扩增曲线可以分成四个时期：基线期，指数期，线性期，平台期。 基线期：扩增曲线的水平部分，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物生成量的变化。 指数期：PCR指数扩增期，扩增曲线起峰，每个循环的产物量与初始模板量符合指数关系，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。 线性期：PCR反应后期，由于PCR反应体系各成分的消耗、产物抑制等因素的影响，反应效率降低，产物量与初始模板量不再符合指数关系。 平台期：PCR反应停止，PCR产物不再随循环数增加而增加。由于影响PCR扩增的因素错综复杂，每个反应进入平台期的时间和平台期的高低都各不相同。  扩增曲线示意图扩增曲线中还有几个重要的名词值得注意！ 基线（baseline）：由于荧光背景的存在，PCR反应的最初3~15个循环的荧光信号变化不大，接近一条直线，即为基线。 基线可以自动生成也可以手动设置，设置时需考虑在消除荧光背景的同时，不能覆盖非荧光背景的扩增信号。同一次反应中对于不同的基因需要单独设置基线，目前各种荧光定量 PCR软件的最新版本允许对单个样品自动优化基线设置。阈值（threshold）：在扩增曲线的指数增长区域内，选择任意适当位置设定的荧光检出界限。 荧光阈值一般由仪器自动设置，也可以手动设置。荧光域值为基线荧光信号标准差的10倍。同一次反应中对于不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要设置相同的阈值。Ct值（Cycle threshold valve）: 指每个PCR反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。 Ct值位于指数期的开始阶段，此时样品间细小误差尚未放大且扩增效率相对恒定，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。Ct值具有重现性，分析时一般取15~35，Ct值太大或太小都会影响定量分析结果的准确性。Ct值的计算方法有两种： 交点法：通过阈值和扩增曲线的交点计算Ct值，Ct值会随阈值的设定位置不同而发生变化，实验间误差较大。二次曲线峰值法：通过将扩增曲线二次求导后取其峰值计算Ct值，Ct值不会随阈值的设定位置不同而变化，实验重现性高，同时能排除仪器检出误差的影响。良好的扩增曲线特征： 基线期平整——基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势；指数期明显——指数期起峰，陡度较大，曲线拐点清楚； 曲线整体平滑——线性期慢慢趋于平整，平台期基本平整；重复性好——复孔间扩增曲线的指数期重复性较好，Ct值尽量一致，相差最好不要超过0.5个Ct值。熔解曲线熔解曲线是反映温度与DNA双链解链程度变化的曲线，以反应温度为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标。 原始图谱：直接反映熔解反应过程中的荧光信号随温度变化的曲线。 导数图谱：利用荧光信号变化的负一次导数（dR/dT）与温度作图得到导数图谱，导数图谱会出现特征峰，更直观地反映PCR产物的解链情况。  熔解曲线的原始图谱和导数图谱Tm值：在某一段温度内，DNA双链随温度升高而大量解链，荧光信号强度骤然下降，致使体系中一半的DNA双链解链的温度称为熔解温度，即Tm值。 不同的PCR产物由于GC含量，片段大小，盐离子浓度的不同，其对应的Tm值也不同，因此可以根据Tm值对PCR产物的特异性进行验证。在导数图谱中，特征峰对应的温度就是Tm值，根据特征峰的位置和形态，可以区分特异性产物和非特异性产物。特异性扩增得到的熔解曲线只有一个紧密的单峰。熔解曲线的解读： 一般来说，根据引物设计原则，荧光定量PCR扩增产物长度在80~200 bp之间，对应的熔解温度在80~90℃之间。 在阴性对照没有扩增的情况下，可以根据熔解曲线验证扩增产物的特异性： 熔解曲线在80~90℃之间出现唯一单峰，表明PCR产物特异性好。熔解曲线出现双峰，在80~90℃之间出现主峰，80℃以下（一般为60~75℃之间）出现杂峰，基本考虑产物中可能存在引物二聚体，可尝试提高退火温度、降低引物浓度、重新设计引物等方法解决。熔解曲线出现双峰，在80~90℃之间出现主峰，90℃以上又出现杂峰，基本考虑有非特异性扩增。若模板中有基因组DNA污染导致非特异性扩增，可通过跨内含子设计引物或去除基因组DNA等方法解决。 标准曲线通常用标准品按照倍比稀释成至少5个浓度梯度，以起始拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标，生成标准曲线，建立Ct值和拷贝数之间的线性关系。  标准品的扩增曲线、熔解曲线和标准曲线根据标准曲线的一些参数可以判断荧光定量 PCR 体系的优劣。 斜率：标准曲线的斜率代表荧光定量 PCR的扩增效率，理论值为-3.32，表示扩增效率为100%，PCR产物的量在每个循环增加一倍。 扩增效率低于100%，其原因可能是PCR反应性能较差，包括引物、试剂和反应条件等不适宜，也可能是标准品稀释不准确。扩增效率高于100%，表明反应体系中可能存在抑制因素，主要包括模板质量较差，模板浓度过高等。有时非特异性扩增也会导致PCR扩增效率过高，需要通过熔解曲线进一步验证分析。PCR反应中并不是每个循环中的模板均能实现了完美倍增，一般PCR扩增效率在90%~110%都可以用于数据分析。 相关系数R^2：R^2是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。 R^2值大于0.99，说明标准品的拷贝数与Ct值之间相关的可信度较好。 条条曲线弯弯绕绕，科研路上绝不绕路。 关注艾科瑞生物，带你“步步为营”，搞懂荧光定量PCR。 |
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