新冠病毒基因组特性分析与检测试剂性能的关联性

2019 新型冠状病毒于 2020 年 1 月 12 日被世界卫生组织（WHO）命名为 2019-nCoV。2020 年 3 月 13 日，世卫组织将 2019 冠状病毒疫情从流行病升级为全球大流行病，疫情已在全球广泛传播。

随着分子生物学技术的发展，分子诊断方法成为病原体检测的一项革命性技术。我国在此次疫情爆发之初，就将核酸检测产品及时应用到了疫情防控之中，是新型冠状病毒肺炎 (COVID-19) 病例确诊的金标准。然而随着核酸检测方法的广泛应用，不断出现的核酸检测假阴性率较高的质疑也成为媒体关注热点。临床学者从标本采集、检测方法、产品稳定性等多方面剖析产生假阴性的可能原因[1]。随着科研人员对新冠病毒基因组的解析，我们对新冠 RT-PCR 核酸检测试剂的检测性能与其基因组特征之间的关联性进行了解析。

2019-nCoV 为单股正链 RNA 病毒，基因组长 29.8kb，病毒基因组全长的三分之二是开放读码框（ORF）。2019-nCoV 主要由结构蛋白和非结构蛋白组成，结构蛋白包括 E 基因编码的包膜蛋白、M 基因编码的膜蛋白、N 基因编码的核衣壳蛋白、S 基因编码的刺突蛋白[2]。

国家药监局应急批准的 30 个新型冠状病毒检测产品中核酸检测试剂 19 个。（插入参考文献：国家药监局应急审批新型冠状病毒检测产品. http://www.nmpa.gov.cn/WS04/CL2056/375802.html）国家卫生健康委临床检验中心《新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》显示，当前应用最广泛的核酸检测方法是荧光定量 PCR 法，而获批的实时荧光定量 PCR 法试剂盒检测靶标主要针对新冠病毒基因组开放性读码框 ORF1ab、N 基因、E 基因保守区域进行引物设计。

一、病毒突变对检测试剂性能的可能影响

前期的研究结果显示新冠病毒传播过程中发生了大量广泛的单核苷酸变异，在最新的李兰娟[3]院士团队的研究结果表明，在对收治的 11 名新冠病毒感染患者体内分离到的新冠病毒进行了病毒突变情况分析后，统计发现有 7 株在 ORF1ab 区域产生 12 个突变，有 2 株在 N 基因区域产生 3 个突变。核酸检测试剂的引物设计通常位于病毒基因组序列的保守区，经过分析比对发现已知的这些突变不在现有试剂引物相应位置及核酸检测靶标部位。越来越多的病毒基因组变异情况得到证实，那么在进化保守区域是否存在突变还未可知，若突变位置发生在病毒 RNA 的引物设计区域，则可能导致检测结果的假阴性。

另一方面，病毒突变也可能对抗体检测产生影响。此项研究同时发现，分离到的 11 株病毒中在 S 基因区域有 8 个毒株产生 10 个突变，其中一个毒株在 S 基因区域的突变导致氨基酸发生了改变，而氨基酸变异可能导致其蛋白构象发生改变，且 S 蛋白是新冠病毒与宿主细胞表面受体结合的主要蛋白。由于结构蛋白发生变异导致患者体内产生针对突变 S 蛋白的抗体，那么就可能导致现在针对未突变 S 蛋白的抗体检测试剂检测不到感染者体内产生的抗体而出现假阴性的情况。

二、新冠病毒转录机理对检测试剂性能的可能影响

在对核酸检测假阴性的分析中也多次提到病毒载量对检测结果的影响。实时 PCR，就是检测 PCR 扩增周期每个时间点上扩增产物的量，是通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板（目的基因）的定量及定性分析。因此反应中病毒载量对应的目的基因含量将直接影响检测结果，而检测试剂的检测限就是检测试剂能检测到的相应反应体系中的目的基因含量，如圣湘生物的新冠检测试剂最低检测限为 200copies/ml，即可检测出 1 ml 反应中的最低病毒载量为 200copies 的病毒。在 2020 年 4 月 23 日《细胞》（Cell）杂志上发表的对新冠病毒的转录组体系结构的研究结果中发现，新冠病毒正链 RNA 进入宿主细胞后，一方面作为 mRNA 指导转录蛋白合成，另一方面通过自身编码的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶作用生成负链 RNA，再以其为模板生成正链基因组 RNA 完成复制，正链基因组 RNA 由结构蛋白包装后组装子代完整病毒。新冠状病毒的一个重要特点是其独特的转录策略，新冠病毒基因组 RNA 还以负链 RNA 为模板进一步合成亚基因组 RNA。新冠病毒转录体中含有大量亚基因组 RNA[4]，ORF1ab 基因由病毒全长基因组转录获得，因此只存在于完整的病毒基因组，而 N 基因同时存在于全长基因组和其他亚基因组 RNA。那么，在新冠病毒转录过程中，其 N 基因转录合成量较 ORF1ab 更高。

我国国家药品监督管理局（NMPA）获批的新冠 PCR 检测试剂中，以双靶标（ORF1ab 与 N 基因）为主，如果单纯检测 ORF1ab 基因的试剂，对于无症状感染者或康复期类型的病毒载量较低患者，理论上患者体内病毒转录合成 ORF1ab 基因含量较 N 基因更低，其检测漏检风险更高，那么从《全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》中对低浓度的病毒检出情况也可以印证这个推论。对于低浓度样本（128 copies/mL）能检出的 NMPA 试剂厂家为圣湘生物及达安基因，均为 ORF1ab 与 N 双靶标检测试剂。

核酸检测产品的即时研发和应用，在 COVID-19 患者的确诊和临床治疗过程中发挥了重要作用，而选择灵敏度高、特异性好、可重复性好的核酸扩增试剂是获得准确检测结果的基础，因此对核酸检测产品的性能及影响因素的关注是非常重要的[5]。

观点小结：

1. 新冠病毒在传播过程中发生了大量广泛的变异，现阶段尚未影响到核酸检测试剂的检测性能，但发生在检测目的基因 ORF1ab 区域及 N 基因的突变需持续关注；

2.S 基因的突变可能导致蛋白构象及免疫原性发生改变，对于抗体检测试剂带来的影响不容忽视；

3.ORF1ab 基因仅存在于全基因组转录过程中，仅针对 ORF1ab 基因的单靶标核酸检测试剂对低病毒载量样本以及病毒突变株易造成漏检，同时检测 N 基因及 ORF1ab 基因的双靶标产品能更好的避免以上因素导致漏检情况的发生。

参考文献

[1] 李振昊, 高小玲, 杨小娟, 徐辉. 新型冠状病毒核酸检测分析 [J/OL]. 检验医学与临床:1-5[2020-04-29].http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1167.R.20200317.1710.002.html.

[2] CUI J,LI F,SHI Z L, Origin and evolution of pathogenic coronaviruses[J].Nat Rev Microbiol, 2019, 17(3):181-192.

[3] Hangping Yao, Xiangyun Lu, Qiong Chen, Kaijin Xu, Yu Chen, Linfang Cheng, Fumin Liu, Zhigang Wu, Haibo Wu, ChangzhongJin, Min Zheng, Nanping Wu, Chao Jiang, Lanjuan Li. Patient-derived mutations impact pathogenicity of SARS-CoV-2. medRxiv 2020.04.14.20060160; doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.14.20060160

[4] Dongwan Kim, Joo-Yeon Lee, Jeong-Sun Yang, Jun Won Kim, V. Narry Kim, Hyeshik Chang, The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome. Cell. 2020. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.011.

[5] 李彩玉, 陈梦媛, 张师音, 葛胜祥. 新型冠状病毒核酸检测「假阴性」原因分析及控制要点 [J/OL]. 厦门大学学报 (自然科学版):1-7[2020-04-29].http://kns.cnki.net/kcms/detail/35.1070.N.20200402.1421.019.html.

编辑： 虞佳男

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