新冠病毒核酸检测PCR技术知识点梳理

近日，由于全国复工复产复学的大量需求，很多线上平台联合各大第三方检测机构，陆续开放了线上预约新冠病毒核酸检测服务。

开通服务的地区，人们可以拿起手机即可便捷的预约核酸检测，最快24小时即可拿到结果。如此便捷的服务，让广大民众欢欣鼓舞，科技的发展又一次为人们的生活带来翻天覆地的变化。

谈技术之前，咱们先说点国计民生重要的事情：

根据国家药品监督管理局官网数据查询信息，国内已有19个新冠病毒核酸检测产品取得医疗器械注册证书，如下图。

而浏览完上表，我们会发现，大部分的新冠病毒核酸检测试剂盒的原理都是基于荧光PCR法，对于一直活跃在科研圈的工作者，自然对鼎鼎大名的PCR技术不陌生，那么荧光PCR、qPCR、RT-PCR等等各种PCR技术，您分得清吗?是不是还在犯迷糊呢?

今天我们梳理一下分子诊断领域的“杠把子”-PCR技术：

PCR，也就是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅扩增，放大，用于后续的检测和基因比对。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。

PCR由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。所有的各种PCR都是在此基础上发展出来的，比如荧光PCR、qPCR、RT-QPCR等。

什么是荧光PCR?

荧光PCR技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点，是对原有PCR技术的革新，扩大了PCR的应用范围。

荧光PCR法根据化学发光原理可以分为染料法和探针法，它们的区别是什么呢?

1.染料法：可用的染料有SYBR®Green I 、SolisGreen® 等;染料能够与DNA双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号。

2.探针法：TaqMan 探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光基团和淬灭基团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光基团和淬灭基团，两个距离较远，发光基团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测到基因的量。

根据扩增策略和检测产物手段的不同，PCR又可分为定性PCR和定量PCR。这里主要说一说定量PCR。

定量PCR，也就是qPCR,由于其英文全称是real-time quantitative polymerase chain reaction，有些也称为RT-qPCR，国外通常简称为qPCR,是由美国Applied Bisystems公司于1996年研制出的一种新型核酸定量技术，并随着荧光PCR 仪的推出而逐渐得到广泛应用。也是现在常用于临床检验的PCR技术，该技术在常规PCR 基础上运用荧光共振能量转移现象( fluorescence resonance energy transfer, FRET) 技术, 加入荧光标记探针, 巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起, 在PCR 指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量, 并据此推断目的基因的初始量。

RT-PCR,实际上是反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)，又称逆转录PCR。国际上的约定俗成的是：RT-PCR 特指反转录 PCR，而 Real-time PCR 一般缩写为 qPCR(quantitative real-time PCR)

RT-PCR原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录称cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因的表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用检测细胞、组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特点基因的cDNA序列等。如果用于定量检测，就是上文提到的qPCR， 此次新冠病毒核酸检测荧光PCR技术，就是基于此。

新冠病毒核酸检测试剂盒优势：

特异识别和检测新冠病毒SARS-CoV-2

适用于人痰液、鼻液、咽拭子样本

可信度高、即用型、快速出结果 < 2 hr

新冠病毒核酸检测试剂盒检测原理图示：