pcr技术发展史

Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌。该酶分子量约为 90 KD，具有 5'→3'DNA 聚合酶和 3'→5' 外切酶活 性，不具 5'→3' 外切酶活性，因此 Pfu 酶可即时的识 别并切除错配核苷酸，具有理想的扩增保真度。常见 热 稳 定 DNA 聚 合 酶 Vent、DeepVent、Tli、Pwo、Pfu、UlTma 等都具有校正功能，但 Pfu 酶比这些校正酶低2~60 倍的低错误率显示出极高的保真度。同时该酶也具有极高的热稳定性，95℃条件下半衰期大于 18 h，97.5℃下半衰期大于 3 h。Pfu 酶是目前使用最广泛的高保真热稳定 DNA 聚合酶，主要用于对 PCR 保真性要求较高的实验，如基因筛选、克隆表达、突变检测、定点突变等等。但此酶也存在一定的不足，如其延伸速率比 Taq 酶低近 6 倍，其原因是酶本身低的催化效率以及来自 3'→5' 外切酶活性的干扰。对于长距离模板的扩增尚不能很好的实现，一般长度在 2 Kb 内的DNA 片段扩增效果甚佳。

随着分子生物学研究的不断发展和深入，PCR 技 术的应用领域也不断拓宽，对热稳定聚合酶的性能要 求也越来越高。除了上述的几种 DNA 聚合酶外，现在很多生物公司利用基因重组和定点突变技术开发出 了具有不同特性的、适应不同研究要求的聚合酶类 型，如 Takala 公司推出的 LA Taq DNA 聚合酶和 EX Taq DNA 聚合酶，不仅聚合能力大大提高，如前者可 以扩出约 30 kb 的超长片断，后者可以顺利扩出 5 kb 的片断，而且均具有 3'→5' 外切酶活性，保证扩出产 物的保真性。再如 Finnzymes 公司利用蛋白质融合技 术将一种双链 DNA 结合蛋白（Sso7d 蛋白）与具有校对功能的热稳定 DNA 聚合酶融合，形成了一种独特的高性能的聚合酶———Phusion 高保真 DNA 聚合酶。双链 DNA 结合蛋白的存在提高了聚合酶对双链 DNA 的亲和力，使得每次酶与双链发生结合反应时 都能够掺入更多的核苷酸，并减少了链延伸所需的结 合反应次数。Phusion DNA 聚合酶的处理能力大约是 Pfu DNA 聚合酶的 10 倍，是 TaqDNA 聚合酶的 2 倍。这种强大的处理能力不仅缩短了延伸时间，而且提高了酶的扩增性能，使其能够在更短的时间里扩增更长的模板。正是这些独特的优点，使 Phusion DNA 聚合酶同时适用于常规 PCR 和要求较高的 PCR。 DNA 扩增的忠实性、特异性和高效性是 PCR 成 败的关键。寻找新的 DNA 聚合酶或利用生物学技术 改造已有的 DNA 聚合酶，是实现或尽量提高上述 3 个目标的主要手段。如何进一步提高热稳定 DNA 聚合酶的酶学性能，成为广大分子生物学研究者关注 的热点。对于热稳定 DNA 聚合酶的研究将使 PCR 技 术更为完善，并更广泛地应用于生命科学的各项研究 领域中。