同源重组 同源臂

要了解同源双交换必须掌握同源重组，因为同源双交换就是进行了两次同源重组。

概念：同源重组是指两个DNA分子之间拥有相同/相似碱基顺序的片段（同源序列/同源性较高的序列）位置发生序列交换，同源重组依赖于序列的同源性。

！！！注意两点： ①　同源性和特异性是两个不同概念；②　交换发生在序列相同或相似的具体位置，而非两个DNA分子之间全部交换。

发生同源重组的几个条件：

1. 重组交换区含有相同或相似的碱基序列；

2. 两个分子之间要相互靠近，发生联会，之后发生互补配对；

3.需要重组酶催化，体内通常不需要另外添加，体外重组要加重组酶。

体内同源重组自然发生，只要了解意思就行；体外同源重组，很多公司都有重组酶卖的，什么一步克隆、无缝克隆大多是利用重组酶进行克隆，难就难在引物设计（以后再讲）。目前解释同源重组的模型有三种：Holiday模型、单链断裂模型、双链断裂模型，我们只要知道序列相同和相似位置发生交换即可。（这几个模型也好理解，需要了解的同学自己去查）

这里主要解析同源双交换，毕竟很多学生硕士毕业甚至都没太搞懂。

同源双交换敲除实验详细解析：

1. 基因上下游同源臂设计（也有实验室叫基因外部同源臂、基因左右同源臂、F端/R端同源臂）

在待敲除基因上下游分别选取一段150-500bp左右的片段，以其作为上下游同源臂模板进行引物设计。上游同源臂正向和反向引物可命名为LF和LR，下游同源臂正向和反向引物可命名为RF和RR。（一共4条引物）在LF的5’加上载体双酶切时的一个酶切位点，在RR的5’端载入体双酶切时另一个酶切位点，在LR和RF的5’端分别加上相同的酶切位点（由你自己设计）。（至于保护碱基和具体怎么选酶，先自己学习一下，或者等以后的帖）

2. 普通PCR将片段扩增出来

以宿主DNA为模板，分别以LF/LR（一组）和RF/RR（一组）进行PCR扩增，之后纯化，酶切（将模板也进行酶切），再纯化，连接。

3. 将连接产物转化进大肠杆菌中

将连接产物转入感受态中，抗生素筛选，送测序。将测序成功的克隆进行培养，提取质粒。

4. 质粒转化/转染

真核生物里一般叫转染，可以化转也可以电转；在原核生物中一般称为转化，可以化转也可以电转，还有一些病原菌可以进行三亲本结合进行接合。

5.质粒与宿主DNA发生联会

6. 第一次筛选（重组）

如果用我示意图的载体，选用Amp抗生素进行筛选，筛选出发生了一次重组的中间体。注意碱基序列方向。

7. 第二次筛选（重组）

在培养基中加入蔗糖，蔗糖存在情况下，存在sacB基因的宿主会致死（自杀），在这样的压力下，发生第二次重组，未发生第二次重组的中间体死亡。就可以得到敲除基因的克隆。

图析：

说明：

1.第一次重组并非一定先发生在L臂，L/R臂都有可能，但是谁先谁后不影响两次重组后的结果；

2.部分宿主内，每次重组并非都是全部交换，而是随机的，具体看宿主本身的重组酶类型，但无论如何交换都不影响敲除效果，只影响敲除后L臂和R臂剩余多少在宿主中，如下图展示L臂部分重组；

3.部分宿主配合部分载体可以一次筛选出敲除单克隆，但其还是发生过两次重组，才能得到敲除基因片段的单克隆（必须一次次交换才有意义，只不过在第一次筛选是抗生素直接加两种，但不是sacB类载体）。