传统分子克隆基础

传统分子克隆依赖重组 DNA 方法，即首先通过限制性内切酶酶切，制备接受 DNA 插入片段的载体。随后，通过连接酶将酶切的片段拼接在一起（即连接过程），形成可以表达目标基因的新载体。这可能是传统克隆最简单、最老的技术，但也为研究人员开发各种新型克隆方法打下了基础，如 TA cloning™、TOPO™ 克隆、PCR 克隆、不依赖连接酶的克隆，以及利用其它修饰酶独特性能的基因组装。

传统分子克隆方法所用的载体基于质粒，而后者为不依赖基因组 DNA 在细菌内复制的双链游离 DNA。所有基于质粒的克隆载体包含许多关键要素，包括：确保在细菌宿主细胞内能有效增殖的复制原；单一酶切位点，或更常见的是，含有多克隆位点 (MCS)，其含有一系列酶切位点，可插入目的片段；载体成功转化后的细菌筛选标记（例如，抗生素耐受）。

在一些载体中，MCS 位于作为标记物的基因内，可筛选已经成功拼接进插入片段的克隆。例如，pUC18 载体中的lacZα 基因经表达编码β-半乳糖苷酶的α 肽段，其和 X-gal 可通过显色来筛选克隆（更多信息请见蓝/白筛选法克隆筛选）。

传统分子克隆载体制备的第一步是，通过限制性酶切构建插入位点。限制性内切酶的选择取决于载体和插入片段上是否存在相应的识别序列以及识别序列的位置，以及是否适于连接。载体图谱上可查到载体上的酶切位点，也可使用 RestrictionMapper 等免费在线工具绘制载体酶切位点。MCS往往是插入片段的首选，因为该区域专用于克隆。

酶切后，为防止载体自连，可能有必要进行载体的去磷酸化，尤其当载体酶切后末端可互补或是平端时。在去磷酸化过程中，碱性磷酸酶可去除末端的 5′ 磷酸基。此处理可避免载体自连，因为连接酶同时需要 5′ 磷酸基和 3′ OH 才能在载体环化过程中连接载体（参见连接）。

载体的去磷酸化对于降低背景、促进所需片段插入载体非常重要。自连载体和带有插入片段的载体都可在转化过程中被细菌摄入， 从而为这些细菌细胞植入抗体耐受性（参见克隆筛选和图 6）。如果载体未经去磷酸化处理，则会产生较高的非所需克隆背景。

根据所用的限制性内切酶，可能需要载体具有平端。为确保成功连接，还建议对所需片段进行纯化。

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克隆的插入片段来源可能为基因组 DNA、另一质粒的一部分或者线性 DNA 片段。无论来源 DNA 类型如何，制备插入片段时常用的第一个步骤是进行限制性酶切，产生匹配的粘性末端，以便接下来将片段插入在载体中。

与载体制备一样，选择适于将插入片段克隆进载体的限制性内切酶。对此最通用的一种策略是，对插入片段和载体进行双酶切，以实现定向克隆。在以下实例中（图 3A），使用了两种可生成不兼容末端的的内切酶（EcoRI 和 KpnI）。由于载体和插入片段末端之间的兼容匹配性（EcoRI 和 EcoRI，KpnI 和 KpnI），二者仅可沿一个方向连接，因而这种方法可实现定向克隆插入片段。

进行双酶切时，同时提供两种酶所需最优的反应缓冲液和反应条件至关重要；因此，为确保酶切成功，应严格遵守制造商提供的双酶切反应建议。

在某些情况下，如果无法找到合适的限制性内切酶，使用所选内切酶消化得到的 DNA末端可能需要平端化。平端化会改变 DNA 末端周围的原始序列；这可能导致基因翻译区域出现移码突变或基因调控区域被破坏。此外，平端 DNA 的连接通常要比粘性末端难度更大、效率更低（图 3B）。

某些情况下，可能会选择一种内切酶同时切割插入片段和载体 DNA，以生成连接所需的互补末端 （图 3C）。该方法常用于基因组 DNA 克隆。

如果出现无法使用单一限制性内切酶的情形，可以考虑换用一对具有不同的识别序列，但是会产生兼容匹配突出端的酶。例如，BamHI 可以识别 5′-G↓GATCC-3′，而 BglII 可以识别 5′-A↓GATCC-3′；这两种酶均可以产生在连接反应中可进行连接的 5′-GATC 突出端。但请注意，在此情形下进行连接后，两个酶切识别位点不可恢复（图 3D）。

通常用来平端化的酶是大片段的 DNA 聚合酶 I 的大片段(“Klenow 片段”)和 T4 DNA 聚合酶。聚合酶的选择取决于限制性内切酶生成的 3′ 或 5′ 突出端。如果生成 3′ 突出端（例如，使用 KpnI ），则首选 T4 DNA 聚合酶，因为其 3′ 至 5′ 核酸外切酶活性比 Klenow 更强。在此情况下， T4 DNA 聚合酶会消化或“回切” 3′ 突出端。如果为 5′突出端（例如，使用 EcoRI ），可使用 Klenow 或 T4 DNA 聚合酶，通过其 5′ 至 3′ 聚合酶活性补齐突出端。个别情况下，可过量加入绿豆核酸酶或 S1 核酸酶，通过二者在单链 DNA 上5′ 至 3′核酸外切酶活性，切除单链 DNA 突出端（图 4）。

插入片段和载体经酶切后（以及之后可能进行的平端化和去磷酸化），可在琼脂糖凝胶上进行电泳并切割出目标片段，纯化所需的片段。通过凝胶电泳还可去除酶切反应物中存在的酶和盐。目前市面上可提供能保证实验流程高效、结果可靠、得率高的凝胶纯化试剂盒。此类试剂盒基于使用促溶试剂、加热来融化凝胶的操作步骤，然后再使用硅胶柱或磁珠纯化片段。为了温和地、有效地回收较长的 DNA 片段（例如，>10 kb 片段），可以结合使用低溶解度凝胶和琼脂糖酶（可分解琼脂糖）。从溶解的凝胶之中回收核酸的传统方法是苯酚/氯仿提取，然后再乙醇沉淀片段。但苯酚/氯仿提取可能会降低得率，且残留的苯酚可能会影响下游实验。为确保成功连接，提取的 DNA 应具有较高的纯度。检验纯度最简单的方法就是测定吸光度：纯净的 DNA 的 A260/A280 比率约为 >1.8，A260/A230 比率约为 2.0。

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获得目标片段后，可以构建连接反应，连接插入片段和载体。连接最常用的酶为 T4 DNA 连接酶，可连接DNA末端的 5′ 磷酸基和 3′ 羟基。T4 DNA 连接反应需要 ATP、DTT 和 Mg2+，这些成分通常由反应缓冲液提供（图 5）。为了改善连接结果，通常建议构建几个具有不同插入片段:载体摩尔比率的反应，通常的比率范围为 1:1 至 5:1。（下载CloningBench 应用程序使用各种便利的工具和计算器，如Vector to Insert Molar Ratios Calculator（载体/插入片段摩尔比率计算器）。）如果连接效率较低，或者由于 DNA 片段为平端，通常建议加入聚乙二醇 (PEG) 等惰性高分子，增加反应组分的有效浓度，进而提高连接效率。

根据 DNA 片段类型和所需的得率，反应温度范围可能为 14°C 至 25°C（室温），反应时间可能为 10 分钟至 16 小时（过夜）。通常，反应温度越高，所需的时间越短，但得率也越低。目前市面上提供了可在短短 5 分钟内获得可靠结果的快速 DNA 连接试剂盒。

连接后的混合物可直接用于化学感受态细胞的转化，如使用电转感受态细胞则之前需要进行纯化。如果连接反应使用 PEG，不建议在反应后热灭活连接酶，因为这样会降低转化效率。

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转化是细菌细胞低频率吸收外界 DNA 的自然过程。在分子生物学实验中，这一过程得到增强，用来在专门为吸收 DNA 而制备的“感受态”细菌内增殖质粒。

市面上提供可实现高效、可靠转染的感受态细胞。制备可进行转化的“感受态”细菌的最常用方法是采用氯化钙处理对数期细菌细胞。将化学感受态细胞和连接反应物混合，然后在 42°C 下热激活，部分 DNA 会被细菌细胞吸收，并在细胞内开始复制。

您可根据实验目标和下游应用，选择不同的感受态细胞菌株。例如，为了进行“蓝/白”筛选，必须选择带有 lacZ 突变 (lacZΔM15) 的细菌菌株。如果实验需要使用甲基化敏感的限制性内切酶进行酶切，则应在dcm–/dam– 细菌菌株内增殖质粒。如用于蛋白表达研究，则菌株应具有 mRNA 稳定性和翻译功能，同时可以较高的重组蛋白表达诱导能力。

此外，感受态细胞的转化效率也是一个重要的考虑因素。生产商会以每微克DNA形成菌落数(CFU/µg)来表示感受态细胞的转化效率，数值范围通常为 1 x 106 至 1 x 109 CFU/µg。在较为困难的连接和克隆中，选择具有最高转化效率的感受态细胞可大幅提升获得目标克隆的几率。

另一个细菌细胞转化方法是电穿孔。这一技术使用电流处理电转化感受态细胞及经连接的质粒，在细菌细胞膜上形成瞬时微孔，以便吸收 DNA。

随后，将转化的细菌（经过热激活或电穿孔后）置于含有适量抗生素的琼脂板上，（通过蓝-白筛选或其它方法）筛选含有所需质粒及插入片段的菌落。

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转化反应同时包含不带载体的细胞、不含插入片段的载体、纯插入片段、以及成功连接的载体和插入片段。不含载体的细菌缺少抗生素耐受性基因，因而不会生长；经转化含有载体的细菌（带或不带插入片段）可表达抗生素耐受性基因，因而可存活（图  6）。因此，可通过抗生素耐受性筛选细菌是否吸收完整质粒。

为确定转化的菌落是否含有插入片段，可采用多种方法，其中最常用的是“蓝/白”筛选法和阳性筛选法。蓝白斑筛选法的依据是，待转化的细菌菌株会表达突变的 lacZ 基因 (lacZΔM15)，而该基因可与载体上编码的β-半乳糖苷酶 α肽段互补（ α互补）。将经转化的细胞涂布到含有 lacZ 转录诱导子、IPTG、 LacZ显色底物 X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的生长培养基上。在蓝白斑筛选中，LacZ 会水解 X-gal，产生蓝色染料进而形成蓝色菌落。当 DNA 插入片段破坏了载体编码的 lacZα 基因时，无法形成功能性 LacZ，经转化的菌落呈白色（图 7）。

另一个流行的筛选方法是阳性筛选法，即在载体的 MCS 之中含有一个对于细菌宿主致命的基因。当插入片段成功连接到 MCS 内的致命基因内，可阻止其表达，从而确保只带有插入片段载体的转化细胞才能存活。

为了更具体地鉴定插入片段，必须进一步分析转化的菌落，因为蓝白斑筛选和阳性筛选法只能确定插入片段是否存在。进行此类鉴定的基础方法之一是，对从阳性菌落或白色菌落中提取的载体进行酶切，检查其在凝胶电泳后最终形成的条带图谱。必须谨慎选择和使用限制性内切酶来确定插入片段的大小和方向。

此外，还可通过菌落 PCR 法判断是否存在 DNA 插入片段，通过 PCR 分析其中的一小部分菌落。此方法需要使用插入片段或侧翼连接载体序列特异性PCR 引物，以便检测插入片段。为了判定插入片段的方向，可以设计一组可通过单次反应检测出载体和插入片段的引物（图 8）。

最明确的插入片段鉴定方法是 Sanger 测序（又称双脱氧测序）。尽管这一方法是确定是否存在插入片段及具体的片段序列的最好方法，但鉴于筛选的菌落数目，这一方法可能较为费时且成本高昂。

确定含有正确插入片段的克隆后，即可直接将其用于下游实验。

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