荧光定量 PCR 实验中的「对照」知多少

1、无模板对照：无模板的阴性对照（No Template Control，简称 NTC）是指使用了水代替荧光定量 PCR 反应中的核酸，其他的试剂按比例正常加入，用于监测反应体系中的污染。正常情况下，NTC 孔中不会有扩增；当 NTC 孔出现扩增时，则预示体系中可能有污染。在 SYBR Green 实验中，EZBioscience 分子生物学实验室总结出了最容易导致 NTC 出现扩增的两种情况：一是通过观察熔解曲线，如果 NTC 与目的基因熔解曲线峰形不重叠（一般 NTC 的 Tm 值较目的基因 Tm 值小），这种情况下，NTC 的 Ct 值是由引物二聚体造成的，此时可通过优化引物的设计来减少引物二聚体对结果的影响。二是 NTC 与目的基因的熔解曲线峰形重叠（即 NTC 的 Tm 值等于目的基因的 Tm 值），此时需要计算目的基因的 Ct 值与 NTC 的 Ct 值的差值（△Ct）：如果 △Ct ≥ 3，气溶胶的污染程度很低，目的基因的 Ct 值可正常使用；如果 △Ct＜3，说明污染已经很严重了，目的基因的 Ct 值是不能使用的。此时就需要想方设法消除体系中的气溶胶污染。

2、无逆转录酶对照无逆转录酶对照（No Reverse-Transcriptase Control，No RT）：在进行逆转录实验时，不加逆转录酶，进行逆转录步骤得到的 cDNA 进行后续的荧光定量 PCR 检测。如果检测到扩增，则样本中可能含有未去除干净的基因组 DNA。EZBioscience®的 EZscript All-in-one Reverse Transcription Kit (with DNase)（货号：RT3），是一款基因组 DNA 去除与逆转录反应在一步进行的新一代快速逆转录试剂盒，包含有设置无逆转录酶的逆转录阴性对照反应所需的 NC Buffer，便于检测 RNA 模板中是否有基因组 DNA 的残留。

3、阴性样本对照阴性样本对照（Negative Sample Control）是指不表达目的基因的样本，也可以是样本保存液。对阴性样本进行了提取、逆转录和荧光定量 PCR 检测。如果出现扩增，则说明其中的某一个实验过程出现了污染，结合 NTC 的结果，来判断是否样本提取过程中引入了污染。