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质谱分析法是一种分析技术方法,可用于研究具有高度特异性的复杂生物化学样品的组成成分。这种技术已经成为了生命科学领域的黄金标准,如蛋白质组学,代谢组学,毒理学。这得益于其特异性和可以量化极少量的荷尔蒙,疾病,生物标志物,代谢物的能力。 质谱分析法面临的挑战 尽管质谱分析法已经被广泛接受,但仍有相当多的挑战阻碍其被临床和研究室采用。 最明显的障碍包括对大型异构样品进行常规分析时分析生产量低,空间分辨率低,如离体组织,在样本解剖结构的背景下从微米到毫米范围内进行测量具有重大意义。质谱分析法成像 (MSI) 成像质谱(IMS)是一种非常灵敏的分子成像技术,可提供组合的分子信息和空间分辨率。它允许从组织切片、单细胞或其他物质表面直接鉴定和定位化合物分子。成像质谱研究的核心特点是质谱仪的高灵敏度、技术的无标签性、对肽和蛋白质的成像能力,以及从个体水平(几百微米)到细胞水平(几十纳米)空间分辨率。成像质谱允许在单个实验中同时检测数千个不同分子的图像。 因此,它是一种有效的多组分分子成像技术。科学家们已经开发了许多不同的成像质谱方案和仪器来研究生物内源性化合物,如脂质、肽和蛋白质,以及外源化合物,如聚合物,或者用于研究组织处理药物的分布。这些研究提供了从亚细胞层次到有机体层次生物过程的详细情况。 ![]() ![]() 质谱成像的解吸和电离技术 IMS需要从被研究物质的表面解离和离子化化合物分子。主要有两种物理方法:(1)用载能带电粒子碰撞分析物表面,(2)用来自脉冲相干光源的光子照射表面。 1、带电粒子的解吸和电离 带电粒子主要用于二次离子质谱(SIMS)成像。在这种方法中,分析物表面暴露于高能聚焦的一次离子束下。 离子撞击会导致表面上下分子的级联碰撞,从而引起表面分子的移动和电离。 随后,碰撞产生的二次离子可以进入质量分析器分析以确定其性质。碰撞能量通常会保持较低,以确保一次离子可以与不同区域表面分子相作用,并且确保已碰撞区域不再进行二次碰撞分析。低于表面层分析碰撞能量的实验被称为静态SIMS实验。高于该碰撞能量的实验,被称为动态SIMS实验。在动态SIMS实验过程中,分析物表面会发生持续的变化。在静态SIMS实验中,被分析的表面通常在1%以内。 在SIMS实验过程中,大量的内部能量被转移到表面分子中。这会导致表层化合物分子产生大量的碎裂。 这使得该方法不适合直接研究大分子物质,如肽和蛋白质等。该方法可以较好地观测待测物表面元素和小分子化合物分布规律。化合物碎裂模式与电子碰撞电离中观察到的碎裂模式相似。 最常用的一次离子种类是铟和镓。它们主要应用于半导体表面上的元素和有机杂质研究,以及薄层表面涂层的研究。受益于较大簇离子或分子离子的应用,切片组织等生物表面也可以被分析。较大的一次离子有Aun+、Binm+、C60+等。这些离子可以使完整次级分子离子的产率更高,并且减少了分子离子碎裂。此外,这些离子的应用还可以显著降低对表面下层分子的破坏,从而增加三维成像实验成功的可能性。 所有的SIMS实验与以上所述的离子光束均需要保持真空环境,否则初级离子会因为平均自由程太短而不能到达分析物表面。解吸电喷雾电离(DESI)是大气压下的解吸和电离技术。它会产生电喷雾液滴,然后在大气条件下被传送到待分析物表面。 溶剂液滴吸附到表面分子上,从而产生与常规电喷雾质谱电离相似的二次离子。 这种方式可以产生带多电荷的准分子离子。据报道,该方法适用于多种待测物的表面分析,包括药物片剂、血迹和组织切片等。研究显示,DESI技术用于组织成像可以可视化观察脑和肿瘤组织切片中的磷脂和脂质。 2、光子解吸、电离 (1) LDI和MALDI 能够从表面解离和电离分子的第二种方法是光子与表面分子产生相互作用。通常,脉冲激光束聚焦在分析物表面上。由表面层吸收的光子能量会导致表面材料的爆炸性去除或消融。 当使用红外(IR)或可见光时,光子能量主要转化为表面振转能量。在紫外线或真空紫外线(VUV)光下,光子能量增加可以引发大量的电子激发。 如果积累在待分析化合物分子中的内部能量足以引起直接电离,该过程被称为激光解吸和电离(LDI),如图1(a)所示。在激光解吸过程中积累的内部能量通常比较高,表面分子可以发生大量的碎裂。此外,有机化合物的低电离效率使得该技术不太适合于大分子质谱分析。 这些情况下,可以应用激光解吸后电离(LDPI)策略来电离解吸过程中产生的中性粒子(图1(b))。后电离策略可以在真空条件下通过UV或VUV波长范围内的二次能量激光束照射实现。 最近研究表明,激光解吸可以有效地与ESI离子源联用,从而在大气压力条件下可以进行激光烧蚀电喷雾电离(LAESI)(图1(c))。这种组合增加了可以用激光解吸策略分析的化合物类别,并能减少化合物碎裂。当与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)组合时,激光烧蚀可以成功地用于待测品表面元素的定量分析。烧蚀的组分被等离子体源雾化并离子化成构成元素和同位素离子,随后通过质谱仪进行分析。当与光发射光谱法结合时,使用从ICP发射的光可以获得更多定量基本信息。 由于存在大量碎裂,直接LDI策略不适用于分子量超过500Da的生物大分子分析。这时可以选择使用能量调节基质。分析物混合或被涂布在待分析物表面上(参见图1(d))可以克服这个限制。在20世纪80年代晚期,由Karas和Hillenkamp构想的这种技术被称为基质辅助激光解吸和电离(MALDI)。 它是现代蛋白质组学研究中的关键技术,可以应用于生物大分子,如蛋白质和DNA分子的解吸和电离。 在复杂待测物表面的MALDI分析中,基质辅助方案有更多的用途。![]() 成像质谱的空间分辨率 IMS的一个关键参数是可实现的空间分辨率。空间分辨率决定细胞和组织表面可观察到的细节。获得质量分辨率图像的最常见方法是使用微探针或扫描模式。微探针模式质谱成像通过SIMS扫描样品上的电离探针束或移动样品通过MALDI对焦进行。对于每个特定位置,带电离子束与样品相互作用,存储坐标,并获得位置相关离子产生的质谱数据。以这种方式构建光栅,光栅中的每个点都具有与其相关联的质谱数据。 使用专用软件,可以从这些数据集中构建质量分辨的离子图像。微探针成像实验中最大的可实现空间分辨率由微探针的尺寸决定。 在技术上,光栅中每个点的精度是控制分辨率的另一个因素,但是对于SIMS和MALDI成像,通常这不是一个问题。 此外,实验实现的空间分辨率受样品制备(基质)和灵敏度(信噪比)相关因素的影响。 1、二次离子质谱(SIMS)和解吸电喷雾电离质谱(DESI)成像质谱的空间分辨率 SIMS使用离子源的大多是由液体金属离子枪构成。Ga +和In +主要用于表面元素和小分子分析。使用这些枪可以获得的空间分辨率由发射器的大小,离子柱中的静电光学元件和主光束电流决定。后者通常保持较低以防止光束的空间电荷膨胀和分辨率损失。 当在低电流下进行调谐时,这两支枪可以提供50nm的焦点。金属簇光束Aun+、Bin+以及C60+可以在非常低的光束电流下提供100-200nm的光斑尺寸。低光束电流通常需要更长的实验时间。因此,为了应用更大的束电流增加分析速度,空间分辨率通常会受到一定损失并减小到大约1μm。DESI使用指向表面的带电溶剂液滴喷射流。喷射流与表面的润湿相互作用中,作用区域大小决定了空间分辨率。 研究表明,DESI成像的常规空间分辨率为1mm左右。 2、激光直接成像(LDI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)成像质谱的空间分辨率 聚焦激光束的分辨率是波长决定的,并受阿贝衍射极限的限制。长波长的红外激光器难以聚焦在50μm以下。商业仪器中的UV激光光斑的物理尺寸限制在约10μm。在商业仪器上,大多数实验用激光光斑尺寸在50和250μm之间。这个选择是由灵敏度和完成实验所需的时间决定的。特殊的共焦目标可以将斑点尺寸减小到1μm,但是使用MALDI的这些小斑点所需的激光阈值通量对于组织中化合物的无损分析是不是太高仍存在实质性的争论。 初步实验显示了其从分析物获取高分辨率图像的能力。替代方法是使用常规MALDI-ToF仪器的过采样方法增加空间分辨率。 在这种方法中,激光探针点的移动增量小于光点直径。所有样品在第一个采样点完成后,每个采样增量都会从比激光焦点尺寸小得多的区域采集信息,从而达到增加空间分辨率的目的。这种方法的两个缺点是有限的质谱串联可能性和较大的总样品消耗量。发展和改进领域 使用上一节描述的解吸和电离技术,可以在复杂表面产生原子和分子离子。质谱图像的产生需要对这些产生的离子进行后续质量分析。现代质谱方法提供了一系列质量分析仪器来达到此目的。本文介绍三种类型的质量分析仪器,为生物表面的MALDI或SIMS质谱成像提供独特的分析能力。 1、飞行时间成像质谱法 IMS中最常用的质量分析器是飞行时间分析仪。它需要产生脉冲离子,这一要求理想地与MALDI和SIMS要求兼容。所有离子都具有相同的加速电位。相同质荷比的离子将在其解吸过程产生的初始动能之上获得相同的动能。 因此, 它们的速度取决于它们的质荷比,并且离子可以通过在无场区域中的漂移而分离。离子检测是通过多通道板(MCP)类的粒子检测器实现的。 ToF分析提供了非常宽的质量范围,该范围仅受大分子物质检测灵敏度的限制。 MALDI-ToF-MS最多可以对数百万道尔顿的分子进行分析。微秒范围内的高传输效率和总飞行时间,为使用高重复率激光器进行高灵敏度表面检测提供了可能性。这使得高通量分析成为可能,而高通量分析正是大表面积样品分析的关键要求。 分辨能力的提高可以通过补偿解吸过程产生的初始动能来实现。 使用延迟提取,半球形静电扇形器件和反射镜等技术可以在m/z 1000下将半峰宽(FWHM)质量分辨率增加到m/△m = 30 000。用于化合物鉴定的串联质谱通常通过碰撞诱导解离(CID)或通过观察电离后亚稳离子的衰变实现。为此,两个独立的ToF系统可以以所谓的ToF / ToF配置串联。第一个ToF用于前体选择,第二个ToF用于产物离子分析。 2、傅里叶变换离子回旋共振质谱法 傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)是一种离子捕获技术,它决定了强磁场中潘宁离子阱中捕获离子的回旋加速频率。在外部离子源产生离子后,离子被转移到潘宁离子阱中,直到进一步分析。使用宽带射频电激发,所有离子被激发到大的回旋加速轨道。它们的轨道半径不仅增加,而在潘宁离子阱中,相同质荷比的离子也相互连贯地在轨道绕行。 在绕行期间,它们可以在一组双检测电极中引起振荡图像电荷。该时域信号被数字化并进行傅里叶变换以产生回旋加速频谱。质谱图可以通过对回旋加速器方程w=qB/m校准产生。 FT-ICR-MS的主要优点是具有无与伦比的质量分辨率和质量测量精度,可用于从MALDI图像分析中发现新的结构细节。此外,使用捕获离子技术不仅允许CID,而且允许红外多光子解离(IRMPD)和电子捕获解离用于串联质谱的结构测定。分析速度受观测时域信号的长度和相关质量分辨率的限制。质量分辨率取决于轨道离子的相干时间。典型的分析时间是每像素1 s,与所用的离子源无关。可以通过增加磁场强度来降低相同分辨率下的瞬态长度。MALDI组织成像实验可以在FT-ICR-MS系统上进行,FWHM分辨率范围从40000到400000。![]() ![]() MALDI成像策略 1、质谱成像流程 不同解吸电离方法与不同质量分析器组合,为在单个组织样品上进行互补实验提供了可能性。 需要仔细的实验设计来确保获得相关的互补分子图像信息。图中显示的实验工作流程提供了从单个组织生成六个补充图像数据集的示例。在该示例中,通过外科手术获得一块组织。组织中的细胞表达荧光标记的蛋白质,因此成像工作流程中的步骤是产生荧光图像。 这提供了一种特定蛋白质的详细位置。在将衬底表面上的10-20μm薄片进行组织切片和安装之后,进行SIMS分析。这提供了在高空间分辨率下的低分子量成像MS数据。静态SIMS除去表面材料的不到1%,因此残留的表面仍然可以进一步分析。SIMS研究完成后,可以用基质涂层覆盖组织表面(参见“基质涂层”一节)。根据感兴趣的分析物,表面可以或不能被洗涤。洗涤方案对所得结果有重要影响。 在图4的实验工作流程中,在基质沉积之前不进行洗涤以允许小的水溶性分子成像。在基质沉积后,进行的第一次分析是ME-SIMS。再次只有少量化合物分子从表面去除,晶体表面保持可用于后续的MALDI分析。ME-SIMS数据集提供了更大的完整有机分子(如脂质和分子量小于2000 Da的小信号分子)的信息。进行的下一个分析是具有略高于解吸阈值的激光注量的MALDI-ToF分析。 MALDI-ToF数据集包含有关内源性肽和完整蛋白的信息(取决于使用的洗涤方案和基质)。 可以获得的最后一个MS成像数据集是MALDI-FTICR-MS数据集(或离子迁移率图像数据集)。这些技术需要去除大多数基质材料。它们可以提供高质量分辨率和质量精度信息,有助于识别构成图像的分子。任何残留的基质材料都可以从多次分析的表面上洗去,以便进行最终的H&E染色。这提供了其他的组织学信息,可以与成像质谱数据集结合来鉴定特定区域或组织类型。 ![]() |
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