绿色荧光蛋白标记的Lewis肺癌小鼠原位模型的建立及鉴定

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，全世界范围内每年都有约1 600万人因为肺癌死亡[1]。对于肺癌的治疗门类众多，但肺癌的预后仍较差且5年生存率仅为7%-18%[2]。建立简单易行便于观察和评估的肺癌模型是目前科研工作的基石。小鼠作为实验对象，既有完备的器官和系统，体积较小，而且繁殖周期短，易于饲养。上述特点都使小鼠成为荷瘤模型建立的最佳选择。

目前的荷瘤模型最常用的是皮下移植瘤，但该方法成瘤脱离了其起源组织的微环境，对荷瘤状态的模拟并不完全，可能会导致实验数据与临床治疗效果有差异。由于肺部位置较深，肺部原位肿瘤的构建过程中，荷瘤操作和肿瘤评估方面均不如构建皮下瘤模型方便，而生物发光系统成像技术的引入解决了这个困扰。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)在395 nm具有最高吸收峰，肩峰为473 nm，发射光谱为508-509 nm。化学性质稳定，灵敏度高且无毒性，是一种独特的报告基因。上述特性使其被广泛应用于各个研究领域[3]。本研究采用的Bruker Xtreme BI活体成像系统，具有多光谱成像功能。本课题组运用GFP标记的肿瘤细胞，利用小动物活体成像仪来观测活体动物肺部荷瘤情况。目前该技术成熟，已被广泛应用。魏淑珍等用增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记的NCI-H460细胞进行裸鼠皮下成瘤，后将肿瘤组织块植入裸鼠肺部，并用小动物成像系统成功鉴定和评估肿瘤[4]。Sakamoto等用GFP标记的DMS273细胞悬液直接注射入裸鼠肺内，并用其检验小细胞肺癌的转移能力[5]。由于裸鼠是免疫缺陷型小鼠，故不能用其建立免疫相关疾病模型，而近些年来对于免疫治疗的研究如火如荼，肿瘤的免疫治疗成为肿瘤治疗的又一突破，因此在近交系C57BL/6小鼠中建立原位荷瘤模型并寻找一种积极可行的评估方法评价显得十分必要。本文阐述了用GFP标记的Lewis肺癌细胞(LLC)建立C57BL/6小鼠肺癌原位荷瘤模型的方法并对其进行了鉴定。

DMEM培养基购自Hyclone公司(AC10215860)；胰酶购自杭州吉诺生物医药技术有限公司(GNM25200)；慢病毒购自苏州吉玛基因股份有限公司；胎牛血清购自Gibco公司(16000-044)；Matrigel胶购自BD Biocoat(356234)。

小动物活体成像仪(型号：Bruker Xtreme BI); 细胞培养箱(Panasonic，MCO-18AC)；小动物辐照仪(PXI，XRAD 225Cx，CT，USA)。

LLC细胞购自中国科学院上海细胞库；C57BL/6小鼠购自湖北省疾病预防控制中心动物实验中心，雌性，6-8周龄，18-20 g，SPF级，饲养于武汉大学中南医院动物实验中心。

将LLC细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，加入含10 μl/ml青霉素和链霉素，将其置于37 ℃恒温，5%二氧化碳培养箱中培养，待细胞融合度至80%，用胰酶将其消化并传代。

转染前1 d铺适量LLC细胞至24孔板，使第2天细胞融合度至30%。取20 μl GFP慢病毒加入400 μl含10%血清培养液，调整感染复数(Multiplicity of Infection, MOI)至20。将原培基弃除并用PBS清洗3遍，加入配置好的含病毒悬液。培养12，24，48 h时分别于荧光显微镜下观察荧光数量及强度。转染48 h后改用15 μg/ml嘌呤霉素的完全培养基培养，每日定时换液，观察细胞状态。若筛选48 h后非转染细胞全部死亡，则稳定表达GFP的LLC细胞系筛选成功。

GFP的LLC细胞将筛选好的细胞系扩增至一定数量，用胰酶将其在37 ℃消化1 min，加入等量10%胎牛血清的培养基终止消化，将混合液吸入至离心管内，1 000 r/min离心5 min，后用PBS重悬，用细胞计数仪计数，调整细胞数量级到106个/ml和等体积Matrigel胶混匀置于冰上。

提前将手术器械(持针器、镊子、剪刀等)高压灭菌。按每10 g体重0.1 ml的剂量，4%浓度的水合氯醛麻醉小鼠。铺中单，后用胶布固定四肢，暴露左侧胸部，剪去左侧胸壁及左上肢腋下的体毛，75%乙醇消毒手术区域，在小鼠腋中线前方，左侧肋弓上缘约1 cm处剪长度约为3 mm的小口，轻柔剪开前方肌肉，后可看到肋骨及肋间隙，用微量进样器抽取混匀的细胞基质胶混合物50 μl，缓慢进针约1-2 cm, 随胸廓起伏向左肺叶缓慢注射混合液。待注射结束后停顿20 s，观察小鼠一般状况，若小鼠状态平稳则缓慢抽出微量进样器，逐层缝合。术后评估小鼠体温，观察呼吸频率，待其自然苏醒。术后观察小鼠一般状态，毛发的光泽度，每日称量小鼠体重。

荷瘤2周后用小动物辐照仪扫描小鼠胸部断层CT成像，观察肺部是否存在占位。同时用小动物成像系统观察肺部占位的生物学活性，小鼠麻醉后用剃毛器剃除小鼠胸部及对应背部毛发，俯卧位置于小动物活体成像仪上成像。在激发波长483 nm，发射波长535 nm，曝光时间1.2 s的条件下得到图像。为进一步明确肺内占位的性质，将荷瘤2周小鼠脱颈处死，打开胸腔观察是否有胸腔内淋巴结转移，取出左肺立即浸入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察其是否具有肿瘤组织特征，鉴定肺部原位肿瘤模型是否成功。

将数据输入Graphad Prism 7.0软件得到折线图及柱状图，用SPSS 16.0做统计分析。采用两独立样本t检验分析数据，以P < 0.05为差异有统计学意义。

将用GFP慢病毒转染的LLC细胞筛选48 h后置于荧光显微镜下观察。光镜下LLC细胞为圆形，体积较小，状态饱满，部分处于分裂期，数量可达整个视野的80%(图 1A)，打开荧光后视野内可见96.2%的细胞带有绿色荧光信号(图 1B)，说明转染效率大于95%。至此稳定表达GFP的Lewis肺癌细胞系筛选成功。

荷瘤小鼠初期一般状况未见明显改变，约1周之后可观察到小鼠毛发光泽变暗，行动较前迟缓，2周之后部分小鼠出现明显恶病质，甚至死亡。从荷瘤小鼠体重变化曲线(图 2)可发现小鼠荷瘤初期体重略有上升，后持续下降。

观察胸部薄层CT所成图像，可见左肺部明显占位(图 3)，在激发波长480-535 nm之间时，小鼠活体成像(图 4)，图中可见荧光信号的部位与之前手术操作的部位相一致，且与CT所显示的有占位的部位相同。

将实验所用24只小鼠脱颈处死，打开胸腔，均未见纵隔淋巴结肿大。13只小鼠左侧肺叶表面可见结节状组织(图 5A)，后HE染色证实一只小鼠肺叶表面未见结节状组织，但在肺组织内有肿瘤形成。故成瘤率为14/24=58.3%。镜下观察HE染色切片，可见肿瘤组织突于肺组织表面，包膜完整，内有少量出血坏死。肿瘤组织中细胞排列杂乱，细胞核深染，核异型性明显，与其邻近肺组织特征完全不同(图 5B)。

有文献表明，接种肿瘤细胞数和肿瘤是否形成及其生长速度有直接关系，当肿瘤细胞剂量级达到1×106时肿瘤成瘤率最高，而更大的剂量级会导致小鼠生存期缩短，更小的剂量级会导致成瘤率下降[6]。故本实验选择1×106作为接种剂量。

小鼠麻醉的深度对于成瘤操作至关重要。操作中发现C57BL/6小鼠若用3%水合氯醛溶液腹腔注射每10 g体重0.1 ml，小鼠处于较浅麻醉状态，四肢肌张力消失，但在有创操作(包括剪开皮肤及胸廓表层肌肉)时小鼠抽动，推测小鼠有轻微痛感，故此麻醉深度过浅，不宜采用。而用5%水合氯醛后，小鼠麻醉状态明显较前加深，有创操作时并无不明显抽动，但约50%的小鼠在手术之后未从麻醉中恢复，怀疑麻醉过量死亡。在4%浓度麻醉下的小鼠翻动反应消失，操作下也不会发生抽动，经过验证为最适宜的麻醉浓度。

小鼠为恒温动物，但在实际操作中发现处于麻醉状态的小鼠体温明显降低，在低温状态下小鼠的生命体征不稳定，手术操作之后苏醒的概率大大降低，不利于造模的成功进行。故在操作时应对室内温度进行评估，若温度过低则可使用加热仪器控制小鼠所处的环境温度。

目前对于小鼠肺癌模型的建立有多种方式。根据不同的实验需要，建立不同的实验模型。有化学诱导的自发肺癌模型、转基因肺癌模型、异位移植模型、原位移植模型和转移模型等若干种[7]。对于肿瘤药物效果和不良事件发生的研究目前采用移植模型。移植瘤模型又分为异位移植和原位移植。异位移植最常见的方法为皮下移植。曹慧慧等首次在国内将Lewis肺癌细胞注入昆明小鼠右腋皮下，形成有完整包膜的肿瘤，成瘤率超过50%[8]。而本文采用的原位移植模型也有不同的方式。一为支气管注射模型，即将肺癌细胞和Matrigel胶混合物通过支气管注入肺内，成瘤后细支气管被压缩，肺泡破坏，肿瘤组织内部亦有出血坏死。其成瘤定位准确，但是操作复杂，对操作仪器和设备要求较高，对操作人员的技术要求也略高，已有实验之后未成瘤的文献报道[9]。再者就是本文采用的将细胞悬液与Matrigel胶混合物用微量进样器直接注射入肺叶。此方法操作简单，小鼠术后死亡率低，是原位荷瘤的理想选择。对小鼠模型的鉴定也有多种途径，micro-CT，小动物活体成像作为活体检测的方法。而包埋后病理检测是检验的最终标准。

综上所述，本文利用GFP标记的LLC细胞成功建立了C57BL/6小鼠肺癌原位荷瘤模型，为免疫治疗等相关研究提供良好的研究和评估模型。