杂交链反应

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作者：

贾泽宇

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摘要：

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术是环境微生物学研究中观察目标微生物的常用工具.然而,以海洋沉积物为代表的环境样品中,微生物细胞的体积,代谢活性限制了单个细胞内的核糖体RNA数量,因此,受信号强度限制的传统FISH难以发挥作用.另一方面,海洋沉积物中大量的非生物颗粒的存在给FISH带来了显著的非特异性结合的问题.通常,信号强度较低的问题可以通过引入信号放大机制来改善,而非特异性信号的存在可以通过改进实验方法或使用合适的对照染色的方法予以解决.本研究中,我们尝试在沉积物样品上验证,优化引入了杂交链反应(Hybridization Chain Reaction,HCR)这一信号放大机制的FISH技术.HCR是一种在特定短链DNA的引发下,具有稳定发卡结构的两种寡核苷酸开环并相互杂交成长链DNA的过程.该长链生成的过程无需酶的参与和温度的改变.针对HCR-FISH,本研究验证了一系列降低非特异性信号的方法,尝试总结适合沉积物样品的HCR-FISH实验流程,并在中国南海等沉积物样品上验证HCR-FISH的性能.通过在代表细菌大肠杆菌(Escherichia coli)上检验已发表的HCR-FISH实验流程,发现了改进HCR-FISH效果稳定性的关键是提高杂交液中起始探针的浓度.改进后的HCR-FISH在代表细菌和古菌Methanococcoides methylutens,Thermococcus eurythermalis上均稳定呈现清晰明亮的荧光信号;测试了五种相互正交的HCR探针组,筛选出了其中两组信号稳定可靠的探针组用于之后的多色杂交.为了降低沉积物颗粒对HCR-FISH的干扰,本研究尝试了多种细胞分离的方法,挑选出了能够尽可能排除非生物颗粒,保留细胞的前处理方法;验证了三类杂交缓冲液对非特异性结合的抑制效果,确认了杂交液中EDTA的优异表现;发现DAPI在结合细胞与非生物颗粒时具有不同的荧光光谱,并据此提出了一套用于降低对照染色非特异性信号的方法;尝试了不以DNA为靶标的其他对照染色方法,拓展了对照染色的应用面.最终,提出了一套适用于海洋沉积物样品的HCR-FISH流程,并在中国南海沉积物等样品上进行验证,定量比较了HCR-FISH与传统FISH的表现差异.HCR-FISH作为一种相对简便的信号增强的荧光原位杂交技术,是研究未培养微生物为主的环境微生物学的重要方法.本研究提出了一套能够在海洋沉积物样品上稳定可靠实施的HCR-FISH流程,该流程也同样适用于海水,淡水等环境样品,为研究海洋原位微生物生理活动,相互作用提供了一套有力的工具.同时,在对照染色上的研究工作可以迁移至其他显微观察的实验流程中,辅助区分细胞与非生物颗粒.本研究提出的优化HCR-FISH流程技术方法为环境未培养微生物研究提供了有力的技术手段.

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