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02 — IPP的装载 站内搜索“image”即可下载安装。 软件自动化研究 —— 可使用 Image-Pro Plus 的 Auto-Pro 编程语言， 将冗长的操作浓缩至一个单一按键或一次鼠标点击上。值得一提的是IPP支持操作者编写宏或者插件，这就属于高阶内容了。如果编写成功，将大大减少工作量，数百张图片的分析可能仅需要不到10min。但是小编自己到目前为止就只成功编写过一次，其它时候经常报错，目前还在挣扎中。高手们可以自己试试哦。 03 — IPP测量平均光密度 软件打开后界面如下。↓步骤：（1）点击file-open，打开一张免疫组化图片。小编推荐大家选择一张典型的图片，其阳性表达和背景色对比强烈，最好是阳性表达是棕黄色而背景颜色为接近白色的图片。因为接下来的“光密度校正”将用到。（2）点击measure-calibration-intensity。↓（3）弹出校正界面(如下) ↓ （4）按照以下顺序点击按钮，将定标标准转换为光密度值而不是灰度值。准备开始定标 ↓。（5）弹出如下界面1。black level下的Image一般为0。我们需点击Incident Level处的Image，进入界面2用鼠标点击所测图片上颜色最浅的一处。界面1界面2可以看到鼠标点击的位置不同，则Current Value值会实时变化。我们要选择最深的颜色，这样在后面测量其它图片时就能囊括那些表达较少、颜色较浅的阳性物质了。然后点击接着点击OK，直到回到第3步的calibration-intensity界面，最小化该界面，千万不要关掉它，否则又得重新定标了。（6）接着点击measure，点击Count or Size打开如下界面。进一步点击该界面的measure，点击Select Measurements跳转至测量指标界面。 测量指标选择Area和IOD，选择完后点击OK。 （7）回到Count or Size界面，点击Select color跳转至测量界面。 这一步，要记得选择直方图HIS模式(图中1)，而不是吸管模式(图中2)。 解释一下，吸管工具只能吸取相同的颜色，对于免疫组化来说显然是不行的，因为同一张图片中明显有深浅不同的阳性表达，此时我们必须要使用HIS模式来获取阳性表达的HIS范围，进而选中所有阳性表达。下次，小编将着重说明吸管工具。（8）HIS模式下，拖动圆圈所示的2条竖向，知道我们将所有的阳性表达都用红色标记出来。此时可见下面的长方框中数值发生变化，接着保存这个测量参数。需要点击左下角方框中的file，存储参数的文件为rge格式。小编建议大家不要更该文件存储位置，因为IPP在读取这个文件时都默认打开此位置。若不然，你每次都得手动找参数文件，比较费劲。（9）做完这些就可以点击close了。然后点击count，可见所有阳性表达均被标记成红色，数值则以绿色显示在图中。 接着，需要点击View，点击statistics或者结果表格；点击file可以进一步输出数据至Excel表格。 我们需要的结果Area Sum和IOD Sum值。（10）最终该图片的平均光密度值则是IOD Sum/Area Sum，这个才是平均光密度。以前很多人会简单的采用IOD Mean这个值来代表平均光密度，小编觉得不妥。因为小编在思考后发现，IPP所计算的IOD Mean仅是图中不同阳性区域的IOD算术平均值。这个值根本没有将面积考虑进去。打个比方，加入图中一共有5处阳性表达，分别为IOD1、IOD2、IOD3、IOD4、IOD5。IPP计算的IOD Mean是这5个IOD的算数平均值。那么问题来了，这5处阳性表达的面积呢？软件是没错的，IOD Sum/Area Sum才是正解。对于这里面的概念，北大有一文章讨论过，感兴趣的小伙伴可以看看。↓（11）后续的测量其实是相同的，机械操作。(除非你能编制自动计算的宏)有2点要注意：第一，图片都必须校正光密度。第二，HIS模式的测量参数必须一致，通过点击file-load file即可调出来直接使用，也手动输入参数。 （12）最后，如果大家对IPP测量感兴趣，可以好好读一下Quantitative analysis of histopathological findings using image processing software”这篇文献，以及其中引用的文献。相信能给你以启发。 |
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