聚乙烯塑料生物降解研究进展

聚乙烯(polyethylene, PE)是一种常见的热塑性塑料，因其具有无臭无毒、耐低温性、高延展性、耐腐蚀性、电绝缘性和化学稳定性等特点被广泛使用[1]。据Plastics-The Facts报道[2]，2021年全球塑料产量达3.9亿t，其中聚乙烯塑料占总产量的26.9%。聚乙烯聚合过程中涉及多种生产工艺，包括气相法、淤浆法、溶液法和高压法工艺等，不同生产工艺中乙烯单体在不同压力和温度条件进行聚合，由此可分为高压聚乙烯、中压聚乙烯和低压聚乙烯3种。高压聚乙烯由于超高分子聚乙烯优异的综合性能，可作为工程塑料使用；中压聚乙烯以注射成型制品及中空制品为主；低压聚乙烯一半以上用于薄膜制品，其次是管材、注射成型制品和电线包裹层等。PE塑料在潮湿土壤中保存12–32年仅显示部分降解和可忽略的质量损失[3]，其难降解的主要原因是PE的相对分子质量大、分子链长、链段结晶度高和较强的疏水性，以及难以与生物接触从而难以进入微生物体内被代谢分解。PE分子结构单元还存在C–C和C–H键，需要较高的能量或作用力才可发生分子键断裂，这极大地限制了微生物对PE的降解。

目前塑料废弃物的处理方法主要包括填埋、焚烧、机械回收和化学回收[1]。由于填埋具有可操作性和低成本的优势，是大多数国家特别是发展中国家处理塑料垃圾的主要方式，但堆积的塑料垃圾会占据大量土地资源，同时造成资源浪费；焚烧塑料垃圾可以减少垃圾填埋场的占用并可回收热能，但焚烧过程中产生二次污染物，如二噁英、一氧化碳和氮氧化物等；机械回收广泛应用于热塑性废料的再利用，但大多数回收材料经过多次加工循环后其性能会受到严重影响，大大降低了其商业价值；化学回收方法可以获得高附加值产物，实现废弃塑料的增值化，但该方法对废弃塑料纯度要求高且生产工艺复杂。据报道，全球回收和焚烧的塑料垃圾只有9%和12%，而高达79%的塑料垃圾被丢弃到垃圾填埋场或自然环境中[4]，探索高效无污染的塑料同级利用方法迫在眉睫。生物降解废旧聚乙烯塑料的最终产物只有CO2和H2O，是解决塑料污染问题的一种生态友好、成本低廉和前景可期的方法。通过筛选以PE为唯一碳源的降解菌株，测定PE降解前后物化性质变化来评价降解菌的降解效率，采用质量损失、表面形貌、力学性能、表面官能团和亲水性/疏水性等方式对菌株的降解性能进行表征，并应用稳定同位素标记技术，以便检测PE结构的改变和代谢产物的生成。本文概述了PE的结构和分类，并对国内外PE降解微生物、降解酶和降解机理等方面的研究进展进行了综述，旨在为PE塑料的生物降解研究提供借鉴。

PE塑料是由乙烯单体发生聚合反应生成的烯烃类聚合物[5]，还包括乙烯与少量α-烯烃的共聚物，是一种典型的热塑性塑料。PE基本结构为[–CH2–CH2–]n，同石蜡和长链烷烃相似，为最简单的高分子量烷烃。PE为典型的结晶聚合物，外观呈乳白色，是无臭、无味、无毒的可燃性白色粉末。

依据聚合方法、分子量和链结构的不同进行分类，PE主要分为高密度聚乙烯(high density polyethylene, HDPE)、低密度聚乙烯(low density polyethylene, LDPE)和线性低密度聚乙烯(linear low density polyethylene, LLDPE)三种类型，如表 1所示。HDPE通常采用Ziegler-Natta催化剂在低温低压下合成，分子中支链少，结晶度高，密度大，具有较高的硬度和机械强度；LDPE采用高压聚合法制造，分子链中存在少量的分支(约2%的碳原子)，具有较低的密度、结晶度和刚性；LLDPE是乙烯与少量高级α-烯烃在催化剂作用下，经高压或低压聚合而成的一种共聚物，与LDPE相比具有强度高、韧性好、刚性强、耐热和耐寒等优点，还具有良好的耐环境应力开裂、耐撕裂强度等性能。

目前PE塑料相关降解菌株的筛选主要是采用选择性培养基，分离自然环境(土壤、垃圾填埋场、活性污泥和海洋等)中的PE塑料降解菌株，或者对分离的降解菌株进行诱变和基因改造。

目前有超过20个属的细菌可参与不同类型PE塑料的降解过程，其中主要包括假单胞菌(Pseudomonas)、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)和芽孢杆菌属(Bacillus)等菌属，这些菌株大部分具有使PE表面劣化和(或)在PE表面形成生物膜的能力。Harshvardhan等[6]从海水中筛选出60种可降解LDPE的细菌，其中沼泽考克氏菌(Kocuria palustris) M16、短小芽孢杆菌(B. pumilus) M27和枯草芽孢杆菌(B. subtilis) H1584能够以PE为唯一碳源进行生长；液体孵育30 d后，PE质量损失率分别为1.00%、1.50%和1.75%，且其表面疏水性均有不同程度地降低；同时证实微生物在PE表面的生长活力，通过傅里叶转换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)数据解析进一步证实了PE的生物降解。Skariyachan等[7]从污水处理厂和垃圾填埋场筛选出可降解LDPE和HDPE的短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)和解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus sp.)，将其混合培养140 d，LDPE和HDPE质量损失率分别为58.21%和46.6%；该研究发现这种新型嗜热菌群能够大规模培养，可作为PE降解的潜在微生物资源。Delacuvellerie等[8]从海水中收集了LDPE塑料，以其作为唯一碳源进行富集培养，并对富集菌群进行分析，发现含LDPE的富集液中烃类降解细菌食烷菌属(Alcanivorax)、海杆菌属(Marinobacter)和栖砂杆菌属(Arenibacter)的丰度明显增加，暗示这些菌属是塑料降解的潜在参与者；通过扫描电镜观察到泊库岛食烷菌(A. Borkumensis)能够在LDPE上特异性形成网格状生物膜来降解石油基塑料，培养80 d后LDPE质量损失率为3.5%。中国科学院海洋研究所孙超岷团队的最新研究成果，首次发现能有效降解聚对苯二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene terephthalate), PET]和PE两种塑料的海洋微生物菌群和降解酶[9]。通过对菌群组成和丰度进行定量分析，发现有5类细菌为优势菌群，进一步成功分离这5类细菌的纯培养菌株，其中微小杆菌(Exiguobacterium sp.)、盐单孢菌(Halomonas sp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.) 3株细菌均具有明显降解PET和PE塑料的能力；以1:1:1比例构建细菌群落处理PET和PE薄膜28 d，通过X射线衍射分析，PET薄膜的相对结晶度从92.55%下降到89.85%，PE薄膜的相对结晶度从49.10%下降到29.50% (表 2)。

参与降解PE的真菌以曲霉菌属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)和根霉菌属(Rhizopus)菌属为主，降解的塑料类型主要是LDPE (表 3)。Awasthi等[23]分离获得可降解LDPE的菌株米根霉(R. oryzae) NS5，摇床培养30 d后，通过FTIR、扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)、原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)和万能拉伸试验机对LDPE薄膜在孵育前后进行了表征，结果表明LDPE薄膜表面物理化学结构产生了明显变化，且薄膜表面有菌丝渗透和降解。Ojha等[24]通过以LDPE和HDPE为唯一碳源，从塑料倾倒场收集的土壤样品中分离出10株真菌菌株，筛选获得可降解PE的两株真菌草酸青霉菌(P. oxalicum) NS4和产黄青霉菌(P. chrysogenum) NS10，培养30、60和90 d后，P. oxalicum NS4对HDPE降解率分别为24.18%、43.73%和55.34%，而相同时段对LDPE降解率为16.72%、26.70%和36.60%；P. chrysogenum NS10培养30、60和90 d后，对HDPE的降解率分别为17.06%、48.00%和58.60%，而对LDPE降解率为19.32%、33.33%和34.35%。Paço等[25]从海洋中分离一株可高效降解LDPE的沿海涛旋孢菌(Zalerion maritimum)，培养14 d后PE质量损失率为56.7%。近期，中国科学院海洋研究所孙超岷团队分离到一株在PE薄膜上具有显著定殖能力的链格孢菌(Alternaria ternate) FB1[18]，通过X射线衍射仪分析发现，菌株FB1处理28 d后的PE薄膜的相对结晶度从62.79%下降到52.02%；利用GC-MS鉴定出一种四碳产物(二甘醇胺)，其占所有降解产物的93.28%。

一些昆虫能够咀嚼和食用塑料外包装或蜂蜡，并将它们作为唯一的碳源，这为PE降解提供多样性的后备微生物资源[26]。Kannan等[26]从印度谷螟(Plodia interpunctella)幼虫体内成功分离出的两种PE降解菌Bacillus sp. YP1和阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae) YT1，能够在60 d内分别降解约6.10%和10.70%的PE薄膜；Bombelli等[27]发现100只大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫在12 h内可导致PE塑料袋的质量损失率达13%。最近，Ali等[28]在小蜡螟(Achroia grisella)幼虫肠道分离两株LDPE降解菌株费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii) LDPE-DB1和Bacillus sp. LDPE-DB2，孵育30 d后，LDPE薄膜拉伸强度分别降低51.30%和58.30%。这些结果表明昆虫肠道微生物富含PE降解微生物，是分离PE降解菌的良好场所。

通过基因组、转录组和蛋白质组等生物信息学技术，对微生物进行基因组成分分析和基因功能注释，挖掘参与PE降解过程中的功能基因，能够从分子水平解析PE的生物降解途径。Yoon等[29]克隆Pseudomonas sp. E4的烷烃羟化酶基因(alkB)在大肠杆菌BL21中表达，37 ℃孵育80 d，能够将约20%的低分子量PE样品转化为CO2，验证了alkB基因对PE具有降解活性。Zampolli等[30]通过测定以PE为唯一碳源的培养基上清液的酶活性和生物信息学分析，证实了编码漆酶样多铜氧化酶基因的激活。Gao等[9]通过基因表达分析同样发现了多种漆酶和过氧化酶基因表达的显著上调。此外，Kong等[31]对食用蜂蜡(类似于PE结构)的蜡螟进行转录组分析，发现编码催化长链烃C–H键羟基化的细胞色素P450酶，羧酸酯酶、脂肪酶和与脂肪酸代谢相关的酶基因上调，这些酶基因可能与PE降解有关。上述研究中的烷烃羟化酶、漆酶、过氧化酶等相关基因的作用表明PE生物降解的过程可能存在定殖、解聚、同化和矿化这4个步骤。

除了上述提到PE降解相关的基因外，Sanluis-Verdes等[32]报道的蜡虫唾液来源的PE降解酶似乎有着不同的降解方式，对已发表的2种来源蜡虫唾液的PE降解酶Demetra (XP_ 026756396.1)和Ceres (XP_026756459.1)进行结构分析，发现2种PE降解酶均有相同的3个血蓝蛋白(hemocyanin)结构域：血蓝蛋白M超家族(hemocyanin M superfamily)、血蓝蛋白C超家族(hemocyanin C superfamily)和血蓝蛋白N超家族(hemocyanin N superfamily) (图 1)。通常来说血蓝蛋白M、C、N会组成一个功能单元，该功能单元的C端具有铜还原蛋白结构域，该结构域具有氧结合作用[33]。因此推测该蛋白C端的铜还原蛋白结构域提供了富氧环境，富氧环境会加速PE的降解速率。

PE塑料降解关键酶的鉴定相对于其他塑料仍很匮乏，功能基因研究鲜有报道，在一定程度上限制了微生物降解PE塑料的研究。因此，后续研究过程中应注重相关降解关键酶的功能研究与降解机制的解析，进一步丰富和完善PE塑料降解功能基因的数据库。

微生物通过分泌胞外酶提高PE表面的亲水性，促进PE的氧化或水解，在塑料生物降解过程中发挥着至关重要的作用，目前已报道的具有PE降解效果的降解酶如表 4所示。

已经证明能够降解含有可氧化C–C键的木质素聚合物的微生物酶可参与PE的生物降解，其中包括木质素过氧化物酶(LiP，EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(MnP，EC 1.11.1.13)和漆酶(Lac，EC 1.10.3.2.) [39]。Pometto等[40]将降解木质纤维素的链霉菌属富集液与PE塑料薄膜振荡孵育21 d，通过傅里叶变换红外光谱、机械性能和PE分子量的变化证明了LiP活性是造成PE降解的主要原因，这是首份参与PE降解的胞外酶活性报告。Iiyoshi等[41]发现木质素降解真菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)分泌的MnP可以降低PE薄膜的拉伸强度和平均分子量，且在Tween 80、Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅲ)螯合剂存在下，部分纯化的MnP导致PE膜的显著降解。Lac不仅能够催化各种多芳香族化合物的氧化，也能作用于非芳香族底物[42]。据报道，来自红球菌(R. ruber) (C208)的铜依赖性漆酶可以降解经紫外线预处理的PE薄膜，Lac介导PE膜氧化裂解，使得中间产物中羰基生成量增加以及PE薄膜质量损失率达75%[34]。虽然研究已经证实过氧化物酶和漆酶能够催化PE的降解，但它们在PE微生物降解过程中的催化机制仍不清楚。

烷烃羟化酶AlkB家族是β-氧化途径中参与PE降解的最重要的酶，可以通过末端或亚末端氧化途径降解烃类低聚物[43]。Yoon等[29]的研究表明，在Pseudomonas sp. E4中重组表达的烷烃羟化酶37 ℃孵育80 d，能够将约20%的低分子量PE样品转化为CO2。Jeon等[37]从滩涂土壤分离到可以高效降解PE的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) E7，通过PCR和序列分析，检测到编码完整的烷羟化酶系统的蛋白质基因alkB、rubA1、rubA2和rubB，它们分别编码烷烃羟化酶、红素氧还蛋白和红素氧还蛋白还原酶。烷烃羟化酶AlkB在烷烃降解的第一步中起作用，并参与电子传递红素氧还蛋白和红素氧还蛋白还原酶系统[44]，是烷烃羟化酶家族中最重要的关键酶。这些结果表明，烷烃羟化酶AlkB可能是PE降解的有效候选酶[37]。

细胞色素P450酶(cytochrome P450, P450)是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，可识别多种底物并催化多种反应，例如C–H键羟基化、C=C双键氧化和C–C键裂解等反应，是一种潜在的PE降解羟化酶。对以PE为唯一碳源生长的浑浊红球菌(R. opacus) R7菌进行反转录分析显示，R7 P450羟化酶的氨基酸序列与催化碳氢化合物甲基支链末端羟基化的CYP124具有32%的同一性，推测R7 P450酶可能参与PE链的氧化[30]。Pinto等[45]对以LDPE为唯一的碳源的生物膜群落进行宏基因组分析表明，随着时间的推移，编码细胞色素P450酶的基因显著增加。此外，Yeom等[46]研究认为P450酶比烷烃羟化酶AlkB更易进行酶工程改造，更适合用于构建降解PE的合成细菌。

随着对PE降解回收的深入研究，微生物酶降解法显示出良好的应用前景，但这些酶的降解效率仍有待提高。现阶段，定向设计和改造解聚酶元件是提高酶结合能力和稳定性的有效手段，这为提高酶降解PE效率提供了可靠的思路和方法。应用蛋白质工程技术来提高塑料降解酶的催化性能是目前热门的研究方向之一，主要包括提高酶的热稳定性，增强底物与酶活性位点的结合，强化底物和酶表面之间的相互作用以提高催化能力。由于对酶结构-功能关系的了解有限，目前对蛋白质进行合理设计大多是经验性的，存在不确定性。但随着人们对酶结构-功能关系的认识不断加深，以及计算机辅助建模和模拟技术的不断发展，将极大地推动塑料降解酶工程的快速发展。

虽然已有证据表明微生物可降解PE塑料，但对该降解机制仍缺乏全面系统的了解。由于PE的主要分子结构与烷烃相似，因此基于烷烃的生物降解机理及有关降解酶参与PE生物降解过程的报道，提出PE塑料的生物降解途径(图 2)[39, 46, 49]。

PE塑料的生物降解过程可分为4个阶段：定殖、解聚、同化和矿化。在定殖阶段，微生物在PE塑料表面附着形成生物膜，通过分泌多糖、蛋白等多聚物，降低塑料表面疏水性，促进微生物分泌的胞外酶与PE塑料表面的分子链的相互作用[50]。然后，微生物通过一系列氧化酶的催化，自由基与PE塑料结合，促成聚合物长链的断链，转化为具有10–50个碳的含氧低聚物[51-52]。这些酶主要包括细胞色素P450酶、烷烃羟化酶AlkB、漆酶和过氧化物酶等氧化酶[49]。其中，细胞色素P450酶通过末端、亚末端和链内羟基化PE[46]。烷烃羟化酶AlkB可以通过末端或亚末端氧化途径降解PE，生成1-烷醇或2-烷醇[37, 43]。漆酶和过氧化物酶可以通过末端氧化途径降解PE，漆酶通过将电子从底物PE转移到分子氧来催化PE的氧化，而过氧化物酶以H2O2为电子受体催化底物PE氧化，引发PE长链的断链，并引入含氧官能团[24, 52-53]。含氧低聚物再进一步被醇脱氢酶、醛脱氢酶、单加氧酶和酯酶作用，形成的脂肪酸进入微生物体内通过β-氧化途径和三羧酸循环分解为CO2、H2O与能量物质[54]。

随着对代谢工程和合成生物学领域探索的不断深入，人工构建微生物工程菌在提高微生物降解性能具有独特的优势，利用基因编辑、蛋白质工程、基因工程等技术提升PE降解酶的催化性能，构建降解PE塑料的工程菌，是生物修复PE塑料污染环境的发展方向[55]。Chen等[56]应用基因编辑技术对降解塑料的关键PETase酶进行了定点改造，成功提高了这种酶分解塑料的效率和热稳定性。基于转录因子TF的生物传感器具有高灵敏度和配体特异性，是目前蛋白质工程筛选新型酶或进化酶的新策略。Liang等[57]在研究迪茨氏菌(Dietzia sp.) DQ12-45-1b菌株烷烃羟化酶-红素氧还蛋白融合基因alkW1的转录调控中，利用生物传感器监测PE单体的产生并转化成可量化的信号比如荧光强度。这种利用生物传感器的高通量筛选将加快寻找新型羟化酶(如P450或AlkB)或改进现有羟化酶的速度，以提高酶在PE生物降解中的活性和稳定性，最终达到解决塑料污染的目的。王玉琪[58]通过分子生物学方法将编码生物表面活性剂鼠李糖脂rh1AB基因插入到具有降解烷烃能力的贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis) Fast30的染色体上，使其对原油的降解效率显著提高了32.05%。谢云[59]采用三亲结合法将目的基因C23O从恶臭假单胞菌(P. putida) BNF1的质粒DNA中转移至宿主菌不动杆菌(Acinetobacter sp.) BS3的染色体中，成功构建了具有较高的遗传稳定性的基因工程菌BS3-C23O。与原始菌株相比，重组菌BS3-C23O对烷烃和芳香烃均具有更好降解性能和更为广泛的底物特异性。

目前筛选到的微生物能够分泌降解PE塑料的降解酶，但其酶产量低且在自然环境中对PE塑料的降解受诸多环境条件的限制，难以达到高效降解的要求。通过基因编辑、蛋白质工程、基因工程等合成微生物学技术在构建PE塑料人工降解菌，提高酶的产量、催化活性和稳定性，并进行工业化生产，以帮助减少塑料污染并改善环境具有重要意义。

PE塑料是典型的人工合成或人工优化过的高分子化合物，由于其极高的疏水性和化学稳定性，生物降解十分困难，同级回收利用技术也不够成熟，因而塑料生物降解成为国内外研究的热点和难点。迄今为止，虽然已报道了诸多能够降解PE的微生物菌株，但降解效率总体不高；在筛选对PE具有不同程度降解效果的微生物时，现有的筛选方法往往通过将PE作为选择培养基中的唯一碳源，忽视了那些在降解PE过程中起协同作用的微生物。目前，塑料生物降解已成为全球瞩目的研究热点，PE生物降解研究仍存在诸多亟待解决的关键科学问题，为此特别要注意开展以下方面的研究。

(1) 建立PE降解微生物高通量筛选技术。传统PE降解微生物的筛选方法不仅通量低、耗时长，还无法有效获得关键降解微生物，因此有必要建立PE降解微生物高通量筛选技术。为规避传统分选方法的劣势，现已研发出新型微生物分选技术，如基于光学镊子结合拉曼光谱的细胞分选技术、荧光活化细胞分选技术和基于激光诱导向前转移技术的细胞分选技术等。这些技术可从复杂样本中识别并分离单个目标微生物细胞，PE降解菌的筛选可借助这些技术从而获得更多的目标降解微生物，既提高成功率，又减少了时间和人力成本。

(2) 集成现代分子生物学技术挖掘PE降解酶或基因。当前已发现4种PE降解酶，其中烷烃单加氧酶通过末端或亚末端氧化降解烃类低聚物，是β-氧化途径中参与PE降解的关键酶。虽然有文章报道部分酶(如AlkB、漆酶、锰过氧化物酶)参与塑料的生物降解过程，但其塑料降解效率仍有待提高。因此，从塑料降解微生物中挖掘更多的PE降解酶和提高酶的降解效率的工作亟待加强。通过多组学挖掘关键代谢产物及降解相关基因，借助基因工程手段对关键降解酶进行克隆、表达、基因敲除与功能验证，以及降解机制解析。

(3) 解析和重构PE降解酶提高催化效率。目前已报道的PE降解酶仍较少，研究者缺少对PE降解酶结构与功能的相关认知，这为酶的工业应用带来困难。随着计算机和人工智能的发展，研究者可利用计算机技术对酶结构进行预测和解析。自然界存在的降解酶往往具有稳定性差、活性和表达量低等现象，可通过定向诱变筛选突变体等蛋白质工程方法来重构PE降解酶，从而增强酶活性、特异性和稳定性等，提高PE降解酶的催化效率。

(4) 耦合PE降解酶开展级联催化途径研究。虽然许多生物催化步骤可通过单酶催化完成，但催化过程可能会受到中间代谢产物的反馈抑制，为解除这种抑制作用，往往需要多酶协同催化才能实现，耦合PE降解酶开展多酶生物催化级联反应研究对解析PE的代谢途径有重要意义。PE代谢途径的解析可深化对PE降解过程的理解，提高PE塑料的降解效率，有利于资源回收及高值化再利用，大幅减少中间代谢产物的产生，降低环境污染风险。

(5) 构建稳定共生的合成微生物群落。协同互补的微生物群落的人工组合在降解PE过程中有良好的效果。事实上，使用单一细菌菌株对环境污染物进行生物降解和生物修复的效率仍然非常有限[60]。由于微生物协同效应互作强化了生物系统中物质转化与能量流动关系，混合菌群具有更高的降解效率。相比之下，关于微生物群落的塑料降解潜力的研究很少，特别是具有高效PE降解功能的微生物组合培养研究。未来可借助多菌种联合、环境宏基因组和共现网络分析等方式发掘在PE降解过程中起着重要协同作用微生物，从而提高微生物降解PE的效率，以及深化对PE微生物降解机制的理解。