使用非病毒方法生产 CAR

第五代 CAR T 细胞添加了其他细胞因子表达域（IL-15 [11]；IL-18 [12]），并且靶向多种抗原的能力——靶向 HER2 + IL13Rα2——在动物模型中成功测试胶质母细胞瘤以防止肿瘤抗原逃逸[13]。

1.3. CAR T 细胞制备的病毒与非病毒方法

CAR T 细胞制备的主要方面之一是选择合适的载体，将 CAR 构建体带入细胞。CAR T 细胞生成最常用的两种选择是基于病毒的载体（通常是逆转录病毒或慢病毒）或非病毒载体，它们主要基于转座子构建 CAR T 细胞。

1.3.1.基于病毒的载体

目前，绝大多数 CAR T 细胞生产依赖于通过病毒载体将遗传信息转移到 T 细胞中。逆转录病毒基因（gag、pol、env）与诱导型启动子结合可提高转导率并产生相对大量的 CAR+ T 细胞（见 [14] 中的综述）。基于载体的鼠白血病病毒 (MLV) 是最常用的 γ 逆转录病毒载体（在 [15] 中进行了综述），并作为一种新方法成功用于 T 细胞免疫治疗严重联合免疫缺陷 - (SCID-) X1 疾病 [16 ]。虽然免疫缺陷疾病得到了成功治疗，但在一些病例中出现了 T 细胞相关白血病 [16, 17]。

源自另一个逆转录病毒家族慢病毒亚科的载体显示出比其 γ 逆转录病毒对应物更好的整合特性。慢病毒载体能够相对容易地靶向非分裂细胞 [18]，而在 γ 逆转录病毒载体中，进入非分裂细胞的转导率明显较低 [19]。慢病毒载体的生物安全性提高是由于不同的整合倾向。γ 逆转录病毒载体更喜欢整合到基因启动子中，这可能是之前描述的致癌特性的原因（在[20] 中进行了综述）。

病毒载体在 CAR T 细胞生产中可能非常有效，但几个关键特征阻碍了它们在临床上的使用，而转而采用非病毒方法。首先，致癌和致突变潜力的可能性需要一种更稳定的载体，最终用于制备临床级 CAR。其次，在当前的良好生产规范 (cGMP) 实验室中使用病毒受到一系列严格规定的束缚，而基因转移的非病毒方法对于临床级生产可能更可行。第三，慢病毒/逆转录病毒转导受到转运 DNA 大小的限制 [21]。最后，一些其他载体系统（例如，利用电穿孔、脂质转染、超声或磁转染进行转导的那些）显着降低了 CAR T 细胞制备的总体价格。一般而言，病毒载体的制造成本往往高于基于转座子的对应物，因为此类载体的制造过程要求更高（参见 [22]）。

1.3.2.非病毒载体

病毒载体最常见的替代品是转座子。已经报道了多种基于转座子的系统用于 CAR T 细胞生产，这些系统提供安全可靠的 DNA 转移到 T 细胞中。睡美人 (SB) 转座子系统目前被用作替代病毒载体，用于制备例如 CD19+ CAR T 细胞 [23]，据报道具有体外和体内抗肿瘤活性[24]。这种方法的主要优势在于转导的遗传材料的整体更好地整合。这种改进的整合是由于整合转座子的启动子活性较低而实现的 [25]。SB系统还在整合位点附近触发更少的表观基因组变化。相对较低的制造成本也是进一步提高 SB 系统地位的重要因素[26]。SB 转座子使用的主要障碍是其显着较低的转基因材料整合率。随着SB系统的进一步发展，集成度低的问题明显减少。SB11 是这种努力的一个主要例子，它的转座率比天然 SB 转座子高 100 倍 [27]。通过对 SB 转座子系统的其他修改，与 SB11 系统相比，SB100X 系统将转座率提高了 100 倍 [28]。

SB 转座子的整合概况接近于随机。SB 系统针对 TA 站点进行集成 [29]。与病毒载体 ([30]) 相比，SB 转座子反复证明对编码序列没有整合偏向 [31, 32]。尽管可以认为 SB 整合谱在生物学上是安全的，但其他转座子载体表现出的特性更类似于基于病毒的载体 [32]。

转座子 Tol2 是适用于创建 CAR T 细胞的成功转座子系统的另一个例子 [33]。与 naïve SB 转座子相比，Tol2 提供了更大的编码能力 (100-200 kb) 和足够的转座活性 [34]。SB 转座子更喜欢 T-A 碱基进行整合，而 Tol2 似乎具有随机整合偏好 [33]。

SB 转座子的最大竞争很可能是 PiggyBac (PB) 转座子系统。与前面提到的转座子类似，PB 转座子使用简单的剪切和粘贴机制将自身整合到人体细胞中。整合位点是非随机的，因为 PB 转座子通常更喜欢 TTAA 序列[36]。PB 整合图谱的映射揭示了与γ-逆转录病毒和慢病毒载体的相似性 [37]，具有与 MLV 逆转录病毒相当的表达基因的插入偏向性 [38]。

与其他（Tol2 和 SB11）转座子系统相比，PB 转座子系统在哺乳动物细胞中表现出优异的转座活性 [39]。在各种哺乳动物细胞中更高的转座活性使 PB 转座子位于潜在的非病毒载体的顶部，用于人类细胞转基因和 CAR T 细胞的制造。

质粒的另一个基本能力是“货物”容量的大小。癌细胞有多种机制来避免免疫反应，而最佳的 CAR 结构需要克服这些机制中的大部分才能使治疗成功。PB 转座子系统被证明能够将多个基因转移到 T 细胞中，从而使它们更有效地用于癌症治疗[40]。Nakazawa 的 [40] 研究还证明了 PB 系统能够以自杀基因的形式携带和转移安全开关到人类 T 细胞中。在严重细胞因子释放综合征 (CRS) 的情况下关闭患者体内 CAR T 细胞的能力可能是该技术最重要的安全特性 [41]。成功分离了 PB 转座子的许多高活性突变变体 [42]。7PB 变体在转座活性方面能够胜过原始 PB 转座子和 SB100X 转座子[43]。改进的 PB 系统的另一个例子是“小鼠密码子优化的 PB 转座酶基因”——mPB [44]。

PB 系统已成功用于生成用于血液系统恶性肿瘤的 CD19 CAR [45] 以及针对选定实体肿瘤抗原的 CAR，例如 CD73 [46]、MSLN[47]、EGFRvIII [48] 和 PSMA [49]。病毒载体与两种最常见的转座子载体的比较见表1。

转座子衍生的质粒载体依赖于将它们递送到细胞中的系统。最近，最常用的方法是细胞电穿孔，其主要优点是程序相对简单，并且该方法的总体成本较低。质粒 DNA 的电穿孔目前正被信使 RNA (mRNA) 的电穿孔所超越。质粒 DNA 进入细胞核的主要障碍是核被膜。因此，分裂细胞表现出比非分裂细胞高得多的转导率[50]。随着 mRNA 转移，克服核膜的需要变得多余，尽管出现了其他问题（主要是与质粒 DNA 相比，mRNA 分子的稳定性降低）。RNA 核苷的化学修饰（例如，掺入假尿苷 [51]）显着降低了 mRNA 稳定性的不足问题。

15 多年前就报道了通过 RNA 电穿孔成功改造小鼠模型中的 T 细胞 [52]，此后在这方面取得了重大进展 [53, 54]。mRNA 介导的 CAR 的临床前测试表明该方法适用于治疗实体瘤 [55, 56]。除了电穿孔，最近在 CAR T 细胞的制备中证明了使用脂质纳米颗粒作为 mRNA 转运的一种形式 [57]。与电穿孔不同，这种方法对转导细胞的毒性要小得多。

尽管这两种方法都适用于 cGMP 质量的 CAR T 细胞生产，但电穿孔的使用频率要高得多。

2. CAR 实践：临床应用

基于 CAR T 细胞疗法的临床试验正在迅速发展，每年提交的临床试验批准请求越来越多。截至2016 年底，全球有 124 项正在进行的 CAR T 细胞疗法治疗血液系统恶性肿瘤的临床试验和 57 项针对实体瘤的临床试验注册[62]。大多数这些试验是在美国或中国进行的。这些试验中不到 10% 是在欧洲进行的。

从那时起，情况发生了重大变化。根据ClinicalTrials.gov 的数据，在 CAR T 细胞疗法的各个阶段有 600 多项临床试验。大多数临床试验仍侧重于血液系统恶性肿瘤（其中 267 项试验涉及靶向 CD19 的 CAR）。 尽管采用转座子载体的研究部分正在稳步增长，大多数正在进行的临床研究采用基于病毒的载体进行 CAR T 细胞制造。尽管在临床应用中尚未观察到对可能的载体诱导致癌激活的担忧，但仍存在理论风险 [63]。

临床中使用的 LV 系统主要来自 HIV-1 病毒。已经实施了几种方法来减少 LV 载体的生物危害特性 [64]。可用于临床实践的此类修饰的一个流行示例是四质粒系统，它能够有效地分割HIV-1 基因组，使病毒基因表达依赖于不同的分离转录单位和仅在生产细胞中表达的负责包装的基因(HEK293T细胞系经常使用）[65]。携带部分 LV 载体的多个质粒的整合最终增加了大规模 CAR T 细胞制造的后勤复杂性；因此，仍然需要更优化的低压系统[66]。病毒构建的 CAR 的主要临床应用仍然是治疗血液相关的恶性肿瘤 [67-69]。

2.1.转座子临床试验

类似于基于病毒的 CAR，转座子介导的 CAR T 细胞临床应用也主要集中在血癌 [23]。通过 SB 载体转导的CD19 特异性 CAR T 细胞已经在 I 期临床试验中显示出有希望的结果 [31, 70, 71]。制备 cGMP 级 CAR T 细胞（用于 I/II 期临床试验）的一种成功方法是利用 SB 系统 DNA 质粒的电穿孔和 T细胞与灭活的 aAPC（人工抗原呈递细胞）的共培养。尽管转座子介导的转导效果较差，但在 28 天的培养过程中重复制备了足够数量 (1010) 的 CAR T 细胞（95% 纯度）[72]。分析使用过的 CAR 的 SB 整合谱显示移植细胞中没有明显的热点或整合偏差。

最近，来自 I/II 期临床试验的初步数据表明供体来源的 CD19+ CAR T 细胞的生物学安全性，为基于转座子的 CAR T 细胞的其他同种异体应用提供了机会 [71]。然而，施用 CAR T 细胞的最佳剂量对于确保治疗的安全性至关重要，因为较高剂量的 CAR T 细胞会导致 I 期和 II 期 CRS [71]。使 CRS 严重程度复杂化的另一个因素是疾病本身的严重程度。在患者接受造血干细胞移植后的短时间内使用 CAR T 细胞疗法（针对血癌）可能有益于降低 CRS 的风险并最终消除患者的残留疾病 [31]。上述研究还记录了在自体和同种异体环境中 SB 介导的 CAR T 细胞的直接比较 [31]。两种方法都产生了相当纯度的 CAR T 细胞，但自体 CAR T 细胞在患者体内的检测时间更长。自体试验患者的总生存率和 30 个月无进展率更高，但两种方法都比标准治疗的患者有显着改善 [73]。

3. CAR T细胞制造

前面提到的所有 CAR T 细胞制备方法都有其优点，但某种方法的最终成功取决于其在严格监管的 cGMP条件下的重现性。这些条件决定了当前细胞疗法生产的复杂规则集。CAR T 细胞制备的每个方面都需要详细记录并符合 cGMP 指南，从洁净室设施的规范开始，到制造将发生的地方，到强调无菌实验室技术、培养基的含量和 直接参与产品培养和最终产品加工（冷冻保存、质量控制测试等）的其他化学品（在 [75] 中进行了审查）。

3.1. CAR T细胞培养

单独的培养过程被认为是基于 CAR T 细胞疗法开发的关键部分。为了避免培养过程中的污染，封闭或半封闭培养系统和生物反应器被认为优于在培养瓶中的简单培养。

G-Rex（Wilson Wolf Manufacturing）代表了一个广泛使用的半封闭细胞生产系统的例子，该系统利用在带有透气膜的烧瓶中进行培养，从而实现更好的气体交换并显着增强细胞增殖。虽然该系统在使用普通培养瓶的基础上进行了升级，但它不是全封闭的，潜在的污染风险可能高于全封闭系统。

完全封闭的系统（例如 CliniMACS Prodigy 或 Quantum 细胞扩增系统）能够在单个管道组内执行整个过程（从细胞转导到扩增）。CliniMACS Prodigy 管组主要专注于通过慢病毒载体转导和随后通过抗CD3/CD28 抗体激活来制备 CD19 CAR [76]。与其他已建立和常规培养技术的产品相比，最终的 CAR T 细胞产品表现出相似的特性 [77]。 Quantum细胞扩增系统普遍用于制造贴壁细胞，如间充质干细胞 (MSC) [78]，但也证明了 CAR T 细胞的扩增是可能的 [79]。

尽管完全封闭的系统最大限度地减少了污染的可能性，但基于病毒的载体的局限性及其总体高成本大大降低了它们在临床实践中的潜在应用。目前对单个患者的 CAR T 细胞治疗成本的估计范围为 150 000 至 300 000 美元 [63, 80]。

通过质粒/转座子制造 cGMP 质量的 CAR 通常仅限于在开放或半开放培养系统中培养，因为电穿孔（或脂质转染）过程在封闭培养系统中尚未自动化。通过电穿孔转导的 CAR T 细胞可以在 cGMP 条件下成功制备 [81]，尽管对人员的无菌技术要求明显更高。

为了提高 T 细胞的转导后扩增和效率，将各种细胞因子添加到培养基中。最常用的促进 T 细胞扩增的细胞因子可能是 IL-2 [82]。尽管越来越多的研究表明更高浓度的 IL-2 可以驱动 T 细胞的 CD8+ 部分进入终末分化，但这种更高的 IL-2 浓度不会促进记忆 T 细胞的形成 [83, 84]。因此寻求不同的白介素组合来改善 T 细胞培养的特性。为了防止 T 细胞发生终末分化，经常使用 IL-7、IL-15 和 IL-21 的组合[85]。IL-21 在促进 CD8+ 细胞毒性方面与 IL-2 相似，但方式相反。添加 IL-21 可抑制 CD8+ 的终末分化，可被视为一种 IL-2 拮抗剂 [86]。IL-7 和 IL-15 促进培养的 T 细胞内记忆表型的形成 [87]。同时，在 IL-7 和 IL-15 组合存在下的T 细胞增殖比在 IL-2 存在下的 T 细胞增殖导致更有效的抗肿瘤 CAR [88]。

与针对血液恶性肿瘤细胞的 CAR T 细胞相比，针对实体瘤细胞的 CAR T 细胞的生存能力和效力在侵袭性肿瘤微环境附近受到影响。为了克服这种抑制，可以用所谓的反向细胞因子受体 (ICR) 修饰 CAR。在 ICR内，白细胞介素 4 (IL-4) 受体与 IL-7 受体融合。这种融合受体能够将调节性 IL-4 信号转变成 IL-7 信号，并最终增强肿瘤微环境中 CAR 的特性 [89]。补充IL-4 的培养基可以提高 CAR T 细胞的肿瘤杀伤能力[90]。

cGMP 的当前趋势倾向于避免在培养过程中使用任何动物源性成分。对无异种培养的强调引起了对培养基成分的关注。常用的动物源性成分，如胎牛血清 (FBS)，优选被无异种替代品替代。最近有报道称，用人血小板裂解物替代 FBS 对 CAR T 细胞状况有积极影响 [91]。

3.2. T 细胞表征

除了不同 CAR 结构的转导方法和细节外，还应解决修饰 T 细胞的特征。绝大多数研究只是利用从外周血或白细胞去除术中分离出来的外周血单核细胞 (PBMC) 的 CD3+部分。在大多数情况下和研究中，CD4+/CD8+细胞的组成以及给定细胞的表型是可变的，这可能导致无法在不同的环境中重现结果。使用先进的富集和细胞分选技术可以相对轻松地解决这个障碍[92]。

还应监测 CD4+/CD8+ 比率，即 T 辅助细胞与 T 细胞毒性细胞的比率。 CD4+/CD8+ 比率的生理值被认为在 1.5 和 2.5 之间，在不同种族、年龄类别等之间存在一些差异（在 [93] 中进行了审查）。正在接受化疗的患者通常具有明显更高的 CD8+ 细胞比例 [94]。CD4+ 和 CD8+ 细胞可分为几种表型亚型-幼稚 (Tn)、效应 (Teff) 和记忆 (Tm) T 细胞呈现 3 种主要的T 细胞表型亚型。记忆 T 细胞可进一步分为长寿命中央记忆(Tcm) T 细胞和短寿命效应记忆 (Tem) T 细胞亚型[95-97]。完全源自 CD8+ 细胞的 CAR T 细胞在体外表现出更高的细胞溶解活性。CD8+ CAR 的 Tcm 亚型在诱发肿瘤的小鼠中显示出最佳的存活率[98]。

同样，CD4+ 细胞产生更多不同的细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）和 CD8+ 细胞，并且每种 CD4+ 表型亚型总体上都提高了小鼠模型的存活率 [98]。CD4+ 和 CD8+ T 细胞之间的协同作用先前已在小鼠模型中得到证实 [99]，并且利用最佳 CAR T 细胞组成可能对患者有益。

4. 结论和未来展望

基于CAR T细胞的疗法目前用于治疗血液系统恶性肿瘤，并且有两种药物已经获得美国FDA的批准，未来具有相似特性的药品数量几乎肯定会增加。在临床实践中更广泛地使用 CAR T 细胞技术的主要挑战可能是 (i) 降低制造成本，(ii) 克服主要的安全隐患，以及 (iii) 通过引入 更高级的构造。尽管病毒和非病毒方法各有优缺点，但非病毒方法在应对这些挑战方面具有巨大潜力，并将 CAR 技术带入血液病领域之外。

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