芍药DELLA蛋白PlGAl1基因启动子的克隆及功能初步分析

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作者：

于璐

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摘要：

芍药(Paeoniaa lactiflora Pall.)为多年生宿根草本观赏花卉,也是东北地区重要的园林绿化植物.但芍药种子具有典型的上,下胚轴双重休眠的特性,生长周期长达半年之久,所以在种子繁殖过程中常常因不能打破休眠而造成萌发率低,严重影响其繁种生产.赤霉素(GA)作为植物体内最重要的激素,对芍药种子萌发和下胚轴伸长有促进作用,使作为赤霉素转录因子的DELLA蛋白家族基因PlGAl1在芍药种子萌发过程中作用突出,而PlGAl1基因启动子调控着基因的转录表达.本研究以芍药杂交后的子代种子(♀粉玉奴×♂粉玉楼)为材料,在已获得的与芍药休眠萌发相关的DELLA蛋白PlGAl1基因的cDNA 1872 bp全长序列的基础上,利用染色体步移技术,成功克隆出芍药DELLA蛋白PlGAl1基因861 bp的启动子序列.主要的实验结果如下:1.芍药不同组织所提取DNA的质量有所不同,用Nanodrop 2000微量分光光度计对所获得的基因组DNA进行浓度,产量及PCR扩增检测,结果表明,从7种组织获得的基因组DNA中,种子,组培苗叶片,成熟叶片的OD260/OD280值在1.80-1.90之间,其中组培苗叶片所提取DNA浓度,产量最高,PCR扩增也最好;其次是种子和成熟叶片;最差的是种皮.2.与NCBI上已公布了其他物种DELLA基因的cDNA序列进行相似性比对,根据DELLA蛋白plGA/1基因同源序列设计两条下游特异性引物,以芍药基因组DNA为模板,利用染色体步移技术克隆DELLA蛋白PlGAl1基因5'端侧翼序列,克隆得到DELLA蛋白PlGAl1基因上游包括CDS区在内1047 bp的DNA片段,与NCBI数据库序列比对后发现PlGAl1基因启动子序列的861 bp为首次克隆.3.通过启动子预测软件PlantCARE发现该序列中发现T/A碱基在启动子的起始密码子附近出现大量富集,还存在一些赤霉素响应元件如GARE-motif,TATC-box,P-box 和一些光响应元件如 GAG-motif,I-box,G-box,TCT-motif,MNF1,Sp1,sbp-CMA1c 等,同时还发现如 AAGAA-motif,ARE,TCA-element,TGACG-motif,Skn-1 motif,as-2-box,circadian等其他顺式作用元件.4.通过PCR技术克隆得到DELLA蛋白PlGAl1基因启动子片段PlGAl1p,利用启动子片段PlGAl1p替换pCAMBIA1301中的35S强启动子,构建了 GUS融合表达载体PlGAl1p-GUS,并成功转入农杆菌LBA4404中.综上研究结果对了解芍药种子萌发的内部调控机制以及为外源基因在芍药种子中的精确定位表达奠定基础,应用该基因启动子对促进芍药以及其他物种的萌发具有重要的意义.

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年份：

2017