免疫荧光染色从小白到大神，看这篇就够了！

对于新手小白来说，免疫荧光染色堪称玄学，片子能不能染上，效果又如何，只能待到镜下检验。

今天丁香实验给大家整理了免疫荧光染色从「样本制备」到「问题分析」的全流程 protocol，建议转发收藏！

对此大师兄建议新手戳视频学习，原理、操作、常见问题分析统统掌握：点此查看操作视频

第一步

样本制作

以冰冻切片为例：首先将组织置于多聚甲醛固定过夜，30%蔗糖脱水后用包埋剂置于-20℃冷冻台上进行冰冻。

将冷冻好的组织块修平，按照不同的组织调整好预切厚度，脑组织一般贴片厚度为15-25um。切好的片子室温晾干后再进行后续染色处理。

点此查看冰冻切片实验

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不同的样本预处理方法不同，关于细胞样本制备：贴壁细胞样本基本原理是使细胞生长在合适的固相支持物玻片上，然后进行固定。

细胞样本的制备

细胞样本的制备

细胞样本的制备

第二步

荧光染色

根据一抗是否直接带荧光标记，将免疫荧光染色分为直接染色或间接染色。

直接染色法是携带荧光素的抗体直接与标本内的抗原反应，形成抗原—荧光素标记抗体复合物，该法优点是较简单，特异性较高；缺点：应用范围较窄，敏感性也较低。

实际上在实验室中，我们最常使用的还是间接染色法，先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。

下面大师兄就以间接染色法为例展开叙述：

实验步骤：

复温：取出制作好的样本（短期存放-20℃，长期存放-80℃保存），恢复至室温后，用1xPBS洗涤三次，每次 5 分钟；

抗原修复：用0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）充分浸泡样本，微波炉中低火加热修复，保持微沸状态5 min效果最好；

破膜：用 0.5%Triton X-100( 1xPBS配制 )室温通透20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

封闭：封闭液蛋白的选择原则是与一抗蛋白和目标蛋白种属不同，将非特异性位点结合掉，从而保证后续荧光染色的特异性。

一抗孵育：用抗体稀释液将一抗稀释成目标比例，4℃过夜。

一抗洗脱：第二天将湿盒拿出复温30 min,用1xPBS洗脱三次，每次5min；

荧光二抗：用抗体稀释液稀释荧光二抗，室温孵育2 h,注意避光;

二抗洗脱：用1xPBS洗脱三次，每次洗脱时间可稍长一些；

封片：用含防淬灭的甘油进行封片，按需可以对细胞核用DAPI进行染色；

拍片：晾干片子后，置于显微镜下观察，获取荧光图像。