如何检测Th1/Th2细胞因子：样本处理

2024-07-07 05:44| 来源: 网络整理| 查看: 265

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Th1和Th2亚群检测 th1和th2细胞因子联科生物Th1/Th2/Th17检测产品列表 Human Th1/Th2/Th17 Staining Kit 人Th1/Th2/Th17染色试剂盒定制Human Th1/Th2/Th17 Staining Kit II Human Th1/Th2 Staining Kit 人 Th1/Th2 染色试剂盒 Human Th17 Staining Kit 人 Th17 染色试剂盒 Mouse Th1/Th2 Staining Kit 小鼠辅助性Th1/Th2细胞检测试剂盒 Mouse Th17 Staining Kit 小鼠辅助性Th17细胞检测试剂盒 FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit 联科生物Treg检测产品列表 Human Regulatory T Cell Staining Kit 人调节性T细胞染色试剂盒 Mouse Regulatory T Cell Staining Kit小鼠调节性T细胞染色试剂盒 FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit 试剂盒组分（以小鼠Th1/Th2检测为例）样本采集及制备血液样本脾单细胞悬液的制备淋巴结单细胞悬液的制备刺激及染色流式检测 1 调节电压和补偿 2 正确设门以得到Th1和Th2细胞在CD3+ CD4+辅助T细胞中的比例结果示例 Th1和Th2亚群检测

通常所说的Th1、Th2是指在各种生理与病理条件下有能力分化为Th1、Th2的辅助性T细胞 (严格意义上是 Th0)。静息状态 (未受任何刺激，如人的正常生理状态)下，Th0分化为Th1、Th2的能力非常弱；当受到外界因素(如刺激素、病原体等)刺激，Th0即会向Th1、Th2等Th细胞分化，此时，通过检测分泌的细胞因子（如IFN-γ、IL-4等）实现对各类Th细胞的检测。正常情况下机体中Th1和Th2处于相对平衡的状态，当这种平衡打破时可能引起多种疾病的发生，如肿瘤、自身免疫性疾病等。

th1和th2细胞因子

Th1/Th2可分泌多种细胞因子，参与不同免疫应答：

Th1：分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-α 等细胞因子，主要介导细胞免疫应答，调节细胞毒性T细胞分化和参与迟发型超敏反应； Th2：分泌 IL-4、IL-10、IL-13 等细胞因子，主要介导体液免疫，促进B细胞增殖、分化和产生抗体。联科生物Th1/Th2/Th17检测产品列表图像占位符

KTH001Th/Treg分型检测试剂盒Human Th1/Th2/Th17 Staining Kit 人Th1/Th2/Th17染色试剂盒 ¥3,200.00 – ¥12,000.00 图像占位符

KTH002Th/Treg分型检测试剂盒定制Human Th1/Th2/Th17 Staining Kit II ¥3,200.00 图像占位符

KTH101Th/Treg分型检测试剂盒Human Th1/Th2 Staining Kit 人 Th1/Th2 染色试剂盒 ¥2,550.00 – ¥9,580.00 图像占位符

KTH117Th/Treg分型检测试剂盒Human Th17 Staining Kit 人 Th17 染色试剂盒 ¥2,680.00 – ¥10,050.00 图像占位符

KTH201Th/Treg分型检测试剂盒Mouse Th1/Th2 Staining Kit 小鼠辅助性Th1/Th2细胞检测试剂盒 ¥1,850.00 – ¥6,940.00 图像占位符

KTH217Th/Treg分型检测试剂盒Mouse Th17 Staining Kit 小鼠辅助性Th17细胞检测试剂盒 ¥1,940.00 – ¥7,290.00 图像占位符

IC001固定破膜剂FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit ¥320.00 – ¥1,140.00 联科生物Treg检测产品列表图像占位符

KTR101Th/Treg分型检测试剂盒Human Regulatory T Cell Staining Kit 人调节性T细胞染色试剂盒 ¥2,970.00 – ¥9,370.00 图像占位符

KTR201Th/Treg分型检测试剂盒Mouse Regulatory T Cell Staining Kit小鼠调节性T细胞染色试剂盒 ¥1,490.00 – ¥4,570.00 图像占位符

IC001固定破膜剂FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit ¥320.00 – ¥1,140.00 试剂盒组分（以小鼠Th1/Th2检测为例）

样本采集及制备血液样本

小鼠血液样本一般采用眼眶后静脉丛采血法，因此法不需麻醉或处死小鼠，对小鼠的伤害小，且可重复采血，具体方法如下：

穿刺采用一根特制的长7～10 cm硬的玻璃取血管，其一端内径为1～1.5 mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将取血管浸入1％肝素溶液，干燥后使用；采血时，左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突；右手持取血管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，当感到有阻力时即停止刺入，旋转取血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中；采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。

注：

用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.2～0.3 ml；为适用于Th1/Th2检测，需用肝素钠来处理取血管，不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠。脾单细胞悬液的制备

脾单细胞悬液的制备通常有两种方法，可依据自己的喜好及习惯来选择。

研磨法小鼠用CO2处死，立即无菌取脾；将脾浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去白色的结缔组织，换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏；再次换入一个装有冷PBS的培养皿中；用小的弯头手术剪剪切脾脏成3 mm 左右的小块；用5 mL或10 ml塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压研磨脾脏小块，此时会看到很多脾单细胞进入PBS中。对于一只30克左右的小鼠，完全研磨脾脏后约可获得100 x 106 左右的细胞；经200目筛网过滤获得单细胞悬液，用冷PBS洗涤2次，每次1000 r/min, 离心10分钟；将细胞悬浮于RPMI1640(含10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；调节细胞浓度为2 x 106 /mL。穿刺法小鼠用CO2处死，立即无菌取脾；将脾浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去白色的结缔组织，换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏；用10 mL注射器的针头在脾脏表面密密麻麻穿刺；用针头吸取培养皿中的PBS，用力注入脾脏中，细胞即会从小孔中流出；彻底冲出脾细胞，用玻璃吸管吸取细胞悬液；经200目筛网过滤获得单细胞悬液，用冷PBS洗涤2次，每次1000 r/min, 离心10分钟；将细胞悬浮于RPMI1640(含 10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；调节细胞浓度为 2 x 106/mL。淋巴结单细胞悬液的制备小鼠用 CO2 处死，立即无菌取出腋下和腹股沟淋巴结；将淋巴结浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去脂肪组织，换入另一个装有冷PBS的培养皿中以清洗脾脏；再次换入一个装有冷PBS的培养皿中；用小的手术剪剪切淋巴结成3-4 mm大小的小块；在培养皿中放置一个孔径为20 um的筛网，用5 ml或10 ml塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压小块，使得淋巴结的单细胞通过筛网进入其下面的PBS液中；用冷PBS洗涤2次，每次1000 r/min, 离心10分钟；将细胞悬浮于 RPMI 1640(含 10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；调节细胞浓度为 2 x 106/ml。刺激及染色对于肝素抗凝血，取125 μl抗凝血至流式管中，加入125 μl不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。取125 μl抗凝血和125 μl不含血清的培养基，作为对照。混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；注：肝素抗凝血样本也可选择方法1b进行处理，在我们的试验结果中，比全血样本能检测到更多的细胞因子，原因未知；对于使用其它抗凝剂(如EDTA、枸橼酸钠)抗凝血，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞 (PBMCs)。用含10%胎牛血清的培养基重悬沉淀，使细胞浓度为1×107/ml。取250μl PBMCs至流式管中，加入1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×) 和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含PBMCs的样本作为对照。混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；对于脾脏组织，使用适当的方法制备成单细胞悬液，并去除团块。(可选)使用淋巴细胞分离液分离制备脾单个核细胞。用含10%胎牛血清的培养基重悬沉淀，使细胞浓度为1×107/ml。取250 μl细胞悬液至流式管中，加入1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含细胞悬液的样本作为对照。混匀，37℃孵育4-6小时，每隔1-2小时取出震荡混匀；注：在我们的试验结果中，脾细胞经淋巴细胞分离液分离后能检测到更多的细胞因子，原因未知；从样本管和对照管中取100 μl细胞悬液至新的流式管中，加入5 μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5。震荡混匀，室温避光孵育15分钟；每管加入100 μl FIX & PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育15分钟；用蒸馏水将10× Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×，每管加入2 ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 g离心5分钟，弃上清；注：液体尽量倒干净，不要有残留；每管加入100 μl FIX & PERM Medium B、5 μl Anti-Mouse IFN-γ, PE和5 μl Anti-Mouse IL-4, APC。震荡混匀，室温避光孵育15分钟；每管加入 2 ml 1× Flow Cytometry Staining Buffer，300 g离心5分钟，弃上清；每管加入500 μl 1× Flow Cytometry Staining Buffer重悬，上机检测；或者加入500 μl 1-4%多聚甲醛重悬，2-8℃避光，于24小时内检测。流式检测 1 调节电压和补偿

推荐使用补偿微球对流式细胞仪进行电压和补偿调节。补偿微球通常比目的细胞小，在调节FSC/SSC电压和细胞设门时需要注意。

2 正确设门以得到Th1和Th2细胞在CD3+ CD4+辅助T细胞中的比例

注：至少获取20000-30000 CD3+ CD4+ T细胞。对于某一细胞因子，因品系和个体差异，分泌该细胞因子的细胞比例差异很大。为了进行统计学差异比较，请获取足够多的细胞样本。需要注意的是，PMA/Ionomycin刺激的细胞中，分泌IL-4的细胞非常低，甚至可忽略。此时，可考虑IL-4的极化培养。

结果示例

使用Mouse Th1/Th2 Staining Kit进行流式检测。正常ICR小鼠的静息肝素抗凝血(A0, B0)、EDTA抗凝血来源的PBMCs (C0, D0)、脾细胞(E0, F0)和脾单个核细胞(G0, H0)染色IFN-γ和IL-4。正常ICR小鼠的 PMA/Ionomycin刺激的肝素抗凝血(A1, B1)、EDTA抗凝血来源的PBMCs (C1, D1)、脾细胞(E1, F1)和脾单个核细胞(G1, H1)染色IFN-γ和IL-4。对CD3+/CD4+细胞进行设门分析。

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