单增李斯特菌氧化还原蛋白系统研究进展

氧化胁迫是细菌生长繁殖中最易受到的压力胁迫之一[1]。氧化剂是食品储存和运输中常用的高效廉价杀菌物质[2]。正常细菌体内广泛存在维持细胞内氧化还原稳态的抗氧化物、抗氧化酶和氧化还原系统，且具有多样性。在革兰氏阴性菌中，二硫键形成发生在具有氧化环境的细胞周质中，而在缺少细胞周质的革兰氏阳性菌中，胞质外巯基-二硫化物氧化还原酶(TDORs)在细胞壁上发挥作用[3]。细胞结构差异滞后了对革兰氏阳性菌TDORs的研究，曾一度认为革兰氏阳性菌中缺乏巯基/二硫键的互换通路，直到近十年，许多革兰氏阳性菌的TDORs才被发现[4–5]。单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌，为食源性条件致病菌，抗氧化压力系统是单增李斯特菌生存进而致病的基础[6]。因此，对硫氧还蛋白家族展开研究有助于理解单增李斯特菌抗氧化应激调控网络和致病机制。

硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶TrxR(TR)和还原底物烟酰胺腺嘌呤(NADPH)组成，硫氧还蛋白还原酶TRs在大肠杆菌(E. coli)中由TrxB编码，负责向氧化态Trxs转移电子。Trxs在E. coli等革兰氏阴性菌中有2个拷贝，位于胞质中的为Trx1，由TrxA编码，是Trx系统中的氧化还原蛋白[7]。位于线粒体中的为Trx2，由TrxC编码，是含有锌离子的独特蛋白，Trx2表达需要Trx系统中的氧化还原蛋白H2O2感受器OxyR的诱导，提示Trx2在氧化环境中执行特殊的功能[7]。

1964年Trx蛋白在E. coli中首次被确认为氧化还原蛋白。E. coli Trx含有108个氨基酸残基，分子量为12–13 kDa，活性位点为“-CGPC-”，结构是4个α螺旋包裹的5个β折叠，称为Trx折叠，是Trx家族特有的结构[8]。

Trx系统的工作原理是还原态Trx[Trx-(SH)2]传递电子至底物中，实现底物的还原，而Trx [Trx-(SH)2]发生氧化转变为氧化态Trxs(Trx-S2)；NADPH负责向TrxR传递电子，使TR保持还原态；还原态的TRs向氧化态Trxs传递电子，使氧化态Trxs转变为还原态，实现氧化还原循环(图 1)。Trx系统具有以下特点：(1) TR结构相对保守，无种属特异性，异源的TR也可以向TrxA传递电子，发挥还原酶作用。(2) Trx系统的底物具有多样性，一般新陈代谢的参与者、抗氧化系统-抗氧化剂酶、氧化损伤修复循环酶和细胞信号通路调节酶等都是Trx系统的底物。通过传递电子到底物中，实现目的蛋白的氧化还原。

单增李斯特菌TrxA由lmo1233编码，含有103个氨基酸，具有CX1X2C基序和Trx折叠，半胱氨酸残基Cys28和Cys31是决定TrxA功能的活性位点。胰岛素还原试验表明TrxA可以高效且特异地还原胰岛素(insulin)，证实TrxA具有还原酶活性。生物学特性分析显示缺失trxA后李斯特菌的生长和存活能力减弱，致病力显著降低，actA、hly等毒力因子的转录水平降低。等温滴定量热(ITC)试验进一步发现TrxA与李斯特菌cAMP受体蛋白家族转录调控因子PrfA(毒力中枢调控蛋白，单体含有4个半胱氨酸)在体外能够发生明显的放热式互作，并对PrfA二聚体进行氧化还原修饰使其处于正确折叠和活化状态，进而调控下游毒力基因的表达并介导李斯特菌发挥致病性[9–10]。该结果表明TrxA通过对PrfA进行氧化还原修饰，进而调控下游毒力因子的表达，介导李斯特菌的致病过程[11]。这与已经报道的GSH作为PrfA的变构激活剂，通过调控PrfA来调控单增李斯特菌的毒力的方式是相似的[12]。证明TrxA催化的氧化还原反应在细菌致病过程中发挥重要作用。

谷氧还蛋白系统(GSH-Grx)由谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽还原酶Gor(GR)和NADPH组成。是机体中另一个主要的巯基依赖性的抗氧化系统，是Trx系统的强有力补充[13–14]。谷氧还蛋白(Grx)是在∆trx缺失株中寻找还原核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase，RNR)的替代物时发现的。Grx负责催化活性位点CX1X2C间巯基和二硫键的互换，参与蛋白质的折叠与修饰，是维持细胞氧化还原稳态以及消除细胞内ROS的另一个重要调节因子[15]。E. coli Grx是含有85个氨基酸残基的小分子蛋白质，具有Trx家族蛋白特有的Trx折叠，其结构是3个α螺旋包裹的4个β折叠。Grxs系统的特点是以GSH为还原剂，参与到底物蛋白二硫键的还原和抗氧化应激防御中。

Grx催化底物蛋白还原的过程与Trx介导的氧化还原过程相似，即还原态的Grxs(Grxred)与氧化态的底物蛋白(substrateox)作用，当底物蛋白二硫键打开被还原为巯基时，Grxs转变为氧化态(Grxox)，随后被GSH还原，在此过程中GSH被氧化成GSSG，进而释放还原态的Grx(Grxred)和氧化态的谷胱甘肽(GSSG)分子；GSSG被NADPH依赖的谷胱甘肽还原酶Gor还原成GSH，实现氧化还原循环[7]。如图 1所示。

与Trx不同的是，围绕Grx的研究还比较少。已知单增李斯特菌GSH-Grx系统中谷胱甘肽还原酶(Gor)由lmo0906和lmo1433编码，GSH由谷胱甘肽合成酶基因GshF合成，Grx由lmo2344编码。胰岛素还原实验发现在二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)存在的条件下，Grx能够有效催化胰岛素二硫键还原，证实Grx具有还原酶活性。氧化应激结果显示，Grx缺失后，李斯特菌更易产生氧化耐受，在遇到肼、Cu2+金属离子氧化剂时Grx缺失株较野生株存活率增高。感染生物学研究表明Grx缺失株的致病力更强。表明Grx在单增李斯特菌氧化耐受和致病过程中扮演着重要角色[16]。等温滴定量热(ITC)试验进一步发现Grx与PrfA之间不存在相互作用，表明Grx不是通过氧化还原PrfA来介导单增李斯特菌致病，提示李斯特菌中存在更为复杂的间接调控网络参与Grx介导的致病过程。过氧化物操纵子调节因子(PerR)是革兰氏阳性菌的氧化压力调控因子，为转录抑制家族成员，被氧化后活性丢失进而诱导氧化应激基因的转录[17–18]。研究表明PerR缺失后李斯特菌对H2O2更敏感，下游受调控的基因如fur、trxB、kat、hemA的转录水平增高[6, 19]。因此我们推测当Grx缺失、李斯特菌暴露于氧化环境时，转录抑制剂PerR发生不可逆的失活，PerR调控的氧化应激基因便失去了抑制，进而介导单增李斯特菌的抗氧化应激和致病过程[16]。

硫氧还蛋白家族成员还包括二硫键氧化还原蛋白(Dsb-样蛋白)[20–22]。Dsb蛋白家族含有DsbA、DsbB、DsbC和DsbD蛋白。Dsb家族成员协同合作，实现蛋白质二硫键的氧化和异构，完成对新生肽链的正确加工。Dsb蛋白的作用过程是，当含有两个半胱氨酸残基的底物蛋白从细胞质进入细胞周质后，氧化还原电位增高，产生空间位阻，促使蛋白质形成二硫键。周质蛋白二硫键的形成由DsbA催化，随后DsbA的活性位点被还原[23]。DsbB是大小为20 kDa的跨膜蛋白，包含两个二硫键的周质环，通过电子传递，实现对DsbA的重新氧化，为开始新一轮催化反应作准备。DsbA具有高度催化活性，同时又具有非底物特异性，当底物中含有多个半胱氨酸时，在DsbA作用下，相邻的半胱氨酸残基形成二硫键，所以容易发生二硫键错配进而影响蛋白质活性。为修复蛋白质中错误折叠的二硫键，在细胞周质中还存有二硫键异构酶DsbC，当蛋白质中含有多个半胱氨酸残基时DsbC会对蛋白质中的二硫键进行重新排列，进而修复错误的二硫键[24]。DsbC以还原态形式存在，其功能发挥离不开伴侣蛋白DsbD的作用，DsbD为二硫键异构还原酶，通过从细胞质向细胞周质传递电子基团在还原DsbC过程中起着关键作用[7]。

原核生物中，Dsb蛋白尤其是DsbA是非常重要的一类蛋白，是Dsb家族中最早发现和研究的一种二硫键氧化还原蛋白，通常与细菌的抗氧化应激和致病密切相关。DsbA是大小为21 kDa的可溶性氧化还原酶，具有Trx折叠，DsbA活性位点为“-CPHC-”序列[25]。

已知单增李斯特菌使用DsbA-样蛋白和DsbG蛋白参与抗氧化应激，但是具体编码基因还不清楚[26–27]。研究报道DsbA突变会导致细菌毒素分泌减少，如霍乱弧菌的霍乱毒素、致病性大肠杆菌的肠毒素和百日咳杆菌的百日咳外毒素；也会导致志贺氏菌、耶尔森氏菌和鼠伤寒沙门菌的T3SS系统不能有效运输效应蛋白[28]。因此，DsbA应该具有介导毒力因子二硫键形成的性质。研究报道单增李斯特菌Spx家族转录调控因子SpxA是响应氧化应激和致病的重要转录调控因子[29]。在其他革兰氏阳性菌中SpxA被蛋白酶体ClpXP降解的过程受YjbH的调控[30–31]。因此，我们猜测YjbH有可能参与单增李斯特菌的氧化还原过程。通过生物信息学分析发现单增李斯特菌存在DsbA家族蛋白(YjbH)，由lmo0964编码，含有CX1X2C基序。氧化应激结果显示，YjbH缺失后，细菌对金属离子氧化剂CuCl2和CdCl2的敏感性显著降低，提示YjbH参与单增李斯特菌的抗氧化应激过程。Co-IP实验显示，单增李斯特菌YjbH与氧化应激转录因子SpxA1发生互作，介导细菌鞭毛蛋白转录抑制子(MogR)二硫键的形成或者异构，提示单增李斯特菌中存在Spx-YjbH-ClpXP的抗氧化应激调控机制。此外，YjbH缺失后单增李斯特菌在小鼠模型中完全丧失毒力，在脾脏、肝脏中的定殖能力均下降。在BHI富营养培养基中PrfA的表达量显著上升且不影响毒力因子转录水平，表明在营养丰富条件下YjbH通过抑制PrfA表达来保持细菌毒力与野生株一致。在CdCl2应激条件下的转录组数据显示，yjbH缺失后导致受PrfA调控的hly等毒力因子转录水平显著下调，且能正调控阻遏PrfA活性的磷酸转移酶系统(PTS)。进一步说明在氧化胁迫条件下，yjbH通过调控PrfA影响细菌的毒力(数据未发表)。

硫氧还蛋白家族成员Trx、Grx和Dsb样蛋白均含有“-CXXC-”催化位点，且活性位点附近有顺式脯氨酸环，相同的结构特征赋予了硫氧还蛋白具有识别底物和催化二硫键氧化还原反应的能力[32]。其次，可能与谷胱甘肽转移酶GshT和谷胱甘肽过氧化物酶Gsh-Px等氧化还原蛋白具有同源性，且均来源于谷胱甘肽结合蛋白[33]。

氧化还原电荷和氧化还原电位是反映氧还蛋白的氧化还原能力的指标[34]。半细胞氧化还原电位(Eh)通常利用GSH/GSSG缓冲系统来表示[35]。Eh越高，还原能力越弱。真核细胞线粒体被认为是还原性最强的场所，TrxR的氧化还原电位与真核细胞线粒体相似，其Eh范围是–280到–330 mV；Trx的氧化还原电位与细胞质相似，Eh范围从–280到–298 mV；Grx的氧化还原电位大约是–225 mV；细胞外胞浆是一个相对氧化的环境，Eh(GSSG)大约是–140 mV，DsbA的Eh是–124 mV[22]。内质网和细菌细胞周质也是氧化环境，Eh范围从–150到–200 mV，是蛋白质二硫键的主要形成场所。因此，三个蛋白还原二硫键的能力强弱顺序为Trx > Grx > DsbA。TrxA和Grx催化的氧化应激反应发生在细胞质中，Dsb催化的氧化应激反应发生在细胞周质中。

三者具有功能交叉性，尤其是Trx和Grx系统的抗氧化应激功能是互补的。缺失了trx1或trx2的E. coli因为有Grx系统的补充仍然可以抵御氧化损伤[36–40]；同理，缺失了Grx系统的幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等致病菌因为有Trx系统也可以抵御氧化应激[14]。另有研究表明GSH-Grx可以代替TrxR还原Trx，在缺硒、添加TrxR抑制剂和TrxR敲除条件下，降低的TrxR可以通过GSH-Grx系统得到补偿。表明GSH-Grx是为Trx提供电子的另一个系统，也说明Trx系统可以还原氧化态GSH[41–42]。而TrxR又可以为DsbD提供电子，进而参与Dsb氧化还原途径。综上，Trx、Grx和Dsb三个系统在抗氧化应激反应中有交互作用。

虽然硫氧还蛋白家族成员均具有氧化还原活性，但是Trx、Grx和Dsb-like蛋白又有区别。表现为：(1) DsbA为二硫化物氧化酶，而Trx和Grx是还原酶。DsbA的作用方式是催化目标底物形成二硫键，而Trx和Grx则是催化底物中二硫键还原为巯基。(2) Trx参与的细胞功能比较广泛，Trx是许多关键酶如RNR、过氧化物酶(Prx)和甲硫氨酸亚砜还原酶(MSRA)的电子供体[43–44]。在二硫键交换反应中，Trx-折叠结构作为电子流动桥梁，执行氧化酶功能，当环境改变时，又可以作为还原酶。例如大肠杆菌Trx在细胞质中是还原酶，但是当它进入胞质外周时，Trx成为氧化剂，有助于蛋白质二硫键的形成[45]。许多细菌均依赖Trx系统来维持巯基/二硫键的稳态和抗氧化应激，参与能量代谢、生物合成、转录和细胞形态调控的257个蛋白均需要Trx1。在某些细菌中，尽管存在低分子量硫醇作为氧化还原缓冲液用以保护细胞免受氧化损，但是Trx系统的基因缺失却是致命的[7]。事实上，即便是在一些生理条件下，硫氧还蛋白对结核分枝杆菌、葡萄球菌的生长是必需的，而Trx1的同源物对类球红细菌、枯草芽孢杆菌和葡萄球菌的生长也是必需的[46–48]。Trx缺失会导致鲍氏不动杆菌等革兰氏阴性菌的疏水性增强进而有可能影响细菌生物学功能[49]。且Trx互作蛋白(TXNIP)可以通过降低活性氧和一氧化氮来促进胞内存活[50]。而关于Grxs或杆菌素/放线杆菌低分子量硫醇依赖的还原途径中Grxs同源物的作用还知之甚少。(3)调控Trx和Grx系统的金属离子不同，含有汞、络和砷的化合物可以抑制Trx系统；而铁离子参与Grx的调控[51]。

进一步分析发现，Trx、Grx和DsbA的活性位点CX1X2C基序也有很大区别。Trx为-Cys-Gly- Pro-Cys-(-CGPC-)；Grx为-Cys-Pro-Tyr-Cys-(-CPTC-)；DsbA为-Cys-Pro-His-Cys-(-CPHC-)。此外Grx还存在单巯基形式，结构域为CXXS[52]。研究表明，活性位点CX1X2C对氧化还原酶活力产生影响。当E. coli Trx活性位点-CGPC-中的P突变为H时，成为蛋白质二硫键异构酶(PDI)的活性位点“-CGHC-”，突变株的氧化还原电位增高，接近于PDI的氧化还原电位，活性增强，催化二硫键形成的能力提高了大约10倍[53]。提示活性位点不同氧化还原蛋白催化二硫键形成能力不同。另有研究表明CysN的解离常数(pKa)也是影响氧化还原酶活力的因素。pKa值因Trx样蛋白的不同而不同，Trx的CysN的pKa值大约为7；Grx的CysN的pKa值约为3.8；DsbA的CysN的pKa值为4.4–6.7[54]。较低的pKa值影响相关硫化物的亲核性和离解能力，提示X1X2序列不同对pKa值有显著影响[55]。X1X2残基不同，向CysN-硫化物提供的氢键数量不同，进而影响Trx家族蛋白的标准氧化还原电位。据此，研究人员提出了Trx家族蛋白和CX1X2C基序发挥作用的基本原理模型，即较稳定的半胱氨酸残基倾向于二硫键氧化反应，不稳定的半胱氨酸残基倾向于二硫键还原反应[55]。因此，活性位点中的X1X2残基通过浓度硫氧还蛋白的氧化还原电位和CysN的pKa值来影响其氧化还原酶活力。

研究报道其他细菌中硫氧还蛋白具有抗应激功能[7, 56]。我们的试验结果首次证实了硫氧还蛋白参与李斯特菌的抗应激过程，但具体的调控机制还有待进一步研究。在单增李斯特菌中含有100多种不同的转录调控子，包括4–5个σ因子和多达15种双元调控系统[57]。已知SigB、PerR、YjbH是重要的转录调控因子。sigB是主要的压力调控因子，细菌受到酸、低温、盐以及氧化胁迫后会激发sigB的调控作用[58]，opuCA/B/C/D、prfA等基因组上近1/10的基因均受sigB的调控[59]，其中包括qoxA/B/C/D、SpxA在内的14个基因参与氧化应激反应[60]。研究报道在次氯酸钠胁迫下，sigB对谷胱甘肽还原酶基因lmo0906的转录无影响，但对抗氧化胁迫蛋白lmo2344(grx)和谷胱甘肽还原酶lmo1433有正向调控作用。表明在次氯酸钠胁迫条件下，SigB参与对grx的调控[61]。我们的研究发现，在氧化剂肼应激下Grx缺失株中lmo1433的转录水平上升4.52倍，sigB转录水平下降3.55倍，氧化应激蛋白lmo0722、qoxA/B、opuCA/B/C/D的转录水平上升，提示在不同应激条件下，李斯特菌Grx发挥调控的方式具有多样性。PerR是主要的过氧化物感应转录抑制因子，可以抑制过氧化氢酶kat、硫氧还蛋白还原酶trxB和预测的过氧化氢酶lmo1604[62]。在枯草芽孢杆菌中，受PerR调控的植物过氧化氢酶1(katA)、氧化还原全局调控因子(spx)和烷基过氧化氢还原酶(ahpC、ahpF)均参与对TrxA的调控[56]。其中Spx能够在巯基特异性的氧化应激条件下调控140多个基因的转录，包括激活trxA和trxB转录来修复胞内氧化应激损伤[63]。而在非应激条件下Spx被蛋白酶体ClpXP降解而识别不到，YjbH特异性识别SpxA的C端又进一步加速了这一降解过程[30–31]。YjbH具有二硫键氧化还原酶活性，是促进全局转录调控因子Spx降解的接头蛋白，YjbH与Spx相互作用进而介导细菌的抗氧化应激反应[30, 64]。由此可见，在单增李斯特菌中硫氧还蛋白的调控机制是非常复杂的。因此，研究硫氧还蛋白的调控因子以及TrxA、Grx和YjbH之间的调控网络对于揭示氧化还原蛋白的应激生物学机制有重要的意义。

与文献报道相似的是，我们的结果表明硫氧还蛋白也可以介导李斯特菌致病[7]。但是不同硫氧还蛋白家族成员如TrxA、Grx和YjbH对李斯特菌毒力的贡献并不相同，甚至完全相反，这也提示李斯特菌硫氧还蛋白家族的致病机制较为复杂精巧，它们之间可能存在相互协作或互为补充的关系。我们下一步将综合前期结果对这些蛋白参与细菌毒力的生物学功能和机理进行全面研究，为揭示单增李斯特菌硫氧还蛋白家族的感染生物学机制奠定基础。

生物信息学分析显示，除了TrxA、Grx和YjbH，单增李斯特菌还含有其他硫氧还蛋白。Gopal等预测出单增李斯特菌中有14个含有典型保守硫氧还蛋白活性位点CX1X2C的同源蛋白[65]。早期研究报道革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌仅编码DsbA，不编码其他任何Dsb蛋白。但是生物信息学分析显示李斯特菌中还含有DsbA家族蛋白的YjbH以及DsbA-样的Lmo1059，且我们试验结果显示Lmo1059可以催化蛋白质间二硫键交换，具有DsbG蛋白的异构酶特性。推测Dsb家族蛋白在不同细菌中的分布不同，如DsbAs和DsbBs之间的相互作用在其他细菌比在E. coli K-12中更为复杂；又如在尿路致病性大肠杆菌(UPEC)CFT073或者沙门菌中，除了经典的DsbA-DsbB系统，还有异构酶系统DsbL-DsbI氧化还原对和毒力质粒编码的DsbA-样蛋白-SrgA[66]。进一步研究发现，Lmo1059与李斯特致病无关(数据未发表)。这也提示我们，含有CX1X2C基序的蛋白在单增李斯特菌中发挥的功能并不完全相同。那么单增李斯特菌中含有CX1X2C基序的其他蛋白是否具有氧化还原活性？各硫氧还蛋白之间是否具有功能交叉性？也是我们未来要探索的内容。