注意！Cas9介导DNA双链断裂修复结果不是随机的！

图1.分析Cas９切割DNA后修复检测流程及结果展示

为了回答这个问题，作者设计了一系列可以同时靶向人类基因组多个位置的sgRNA，总共有22个sgRNA，每个sgRNA在基因组上有2~14个靶点，共计127个靶点。

再次按照图1的流程进行实验分析后，作者发现，很多相同靶点虽然背景序列不同，但是其修复的结果高度一致（每个靶点三次独立重复实验）。以其中的第15号sgRNA的结果为例（图2），该sgRNA在基因组上有7个靶点，所有靶点的修复结果都非常相似，主要是单个腺嘌呤的插入和一个碱基的缺失。

图2.第15号sgRNA介导Cas9切割靶点后修复结果展示

整体来看22个sgRNA，其修复结果在不同的基因背景下都非常接近（图3）。比如第6号sgRNA在基因组上有14个不同的靶点，第11号sgRNA在基因组上有10个不同的靶点，第22号sgrNA在基因组上有10个不同的靶点，其修复结果中不同类型（插入或者缺失，插入什么碱基，缺失什么位置多长片段）的比例都高度类似，说明Cas9切割产生的双链DNA断裂其修复结果是非随机且依赖protosapcer序列的（sgRNA靶向的序列），而与protospacer所在基因组上的背景序列无关。作者同时在K562中进行该验证，验证结果得出和293T细胞相同的实验结论。

图3. 在293T细胞中，22个sgRNA靶点修复结果展示

DNA双链断链的主要修复同路包括NHEJ，MMEJ，SSA和HDR；由于SSA（单链退火）会导致大片段的缺失，HR是一种无错的修复方式，所以目前观察到的修复结果主要是NHEJ或者MMEJ导致。为了研究这两种修复方式对于修复结果的影响，作者对比了添加NU7441对于修复产物比例的影响。NU7441是一种DNA PKcs的抑制剂，可以抑制NHEJ修复通路。在添加NU7441后，观察到1bp的插入和1-3bp的缺失比例明显降低（图4），这说明在Cas9导致的DNA双链断裂的修复过程中，NHEJ主要参与1bp的插入和1-3bp的缺失，4bp以上的缺失主要是MMEJ修复通路导致的（微同源序列参与的，MH）。

图4. 在细胞中添加DNA-PKcs抑制剂NU7441，抑制NHEJ后对比DNA修复结果变化

这篇文章向我们展示了一项非常有趣的研究结果，即Cas9导致的DNA双链断裂并不是被随机修复的，修复结果具有很强的靶点特异性。我们先看看这个结果给我们实验上的启示：如果认为DNA双链断裂修复过程是完全随机的，在确定靶点能够有效切割DNA后，使用混合克隆株直接验证wb的敲除效率一定会是有效的（2/3的移码概率）；但是由于修复结果具有很强的靶点特异性，如果其中大部分是缺失3bp或6bp这类不产生移码的突变，那么此时即使有编辑基因组，蛋白水平很可能没有差异。另外，特定靶点对应特定的修复结果，暗示我们可以寻找合适的方法直接预测DNA修复结果，这样我们就可以直接设计特定sgRNA产生我们预期碱基的插入或者片段缺失，且相对于传统的KI，其相率将高出非常多。

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【参考文献】

Megan van Overbeek et al. DNA Repair Profiling Reveals Nonrandom Outcomes at Cas9-Mediated Breaks. Mol Cell. 2016 Aug 18;63(4):633-646.返回搜狐，查看更多