彗星电泳实验常见问题与结果分析【附视频教程】

一、彗星实验的背景与原理

在了解彗星电泳之前，先了解一下DNA损伤的类型，比如单碱基的突变、单碱基的缺失、多碱基的突变、多碱基的缺失以及双链的断裂、碱基的插入、编辑等。

而造成DNA损伤的因素主要有以下几点：ROS活性氧、紫外线、抗肿瘤药物。

分子水平检测DNA损伤的方法有以下几个：

WB：检测γH2AX

qPCR：检测DNA损伤表达

彗星电泳：单细胞凝胶电泳

1984年，Ostling和Johanson第一次用中性彗星电泳定量细胞中的DNA损伤；而中性彗星电泳只能检测双链的DNA损伤；后来Singh发展出碱性彗星电泳，它是一种更灵敏的方法，可检测单链、双链的DNA损伤和碱不稳定性位点DNA交联及不完全切除修复位点等多种DNA损伤，适用于检测各种物质的基因毒性。

彗星电泳的实验原理：

电泳过程中，带负电荷的DNA会向正极移动，DNA损伤会产生小的DNA碎片，这些碎片会在琼脂糖凝胶中移动，形成彗星状拖尾，而完整的DNA是因其分子量比较大，无法从细胞核迁移出来。

二、彗星电泳实验步骤和结果分析

实验步骤

实验步骤有两个关键需要注意一下：

1、实验过程避光；

2、裂解液pH调至10；

实验结果与分析

阴性对照没有拖尾的形状

而阳性对照组有很明显的拖尾形状

对于拖尾率的计算有专门的计算公式，首先要统计到尾部DNA的含量，即尾部DNA的光强度比上整个细胞的光强度，计算公式详见下图：

三、彗星电泳实验的适用范围

主要用于检测基因毒性，例如，检测药物的基因毒性。

优点：灵敏、直观、低成本，需要的细胞数量少，实验周期相对短，可以广泛应用于各种细胞；

缺点：1、易受环境影响，例如紫外、氧化压力；

    2、该实验的通量受限于玻片；

    3、只能简单的反映细胞内碎片化DNA的比例，要全面分析DNA损伤还需要其他实验的佐证。

四、彗星电泳经典案例一览

五、彗星实验常见问题及分析

问题1：对照组出现拖尾

原因：样品消化过度或者样品反复冻融

问题2：没有拖尾

原因：细胞裂解不充分

问题3：铺的胶易脱落

原因：胶凝固时间不够

问题4：背景太脏

原因：琼脂糖凝胶，裂解缓冲液和解旋缓冲液都要现配现用。

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彗星电泳实验  视频教程地址（建议微信打开）：http://weike.fm/WjiC6156df

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