寨卡病毒包膜prM

寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)是一种由蚊子传播的虫媒病病毒, 可以导致新生儿“ 小头症” 。该病毒最早于1947年发现于乌干达寨卡丛林的恒河猴体内, 随后于1948年在非洲伊蚊体内分离得到寨卡病毒, 1956年学者通过喂食小鼠和猴子感染ZIKV的伊蚊, 成功地复制了ZIKV的感染[1]。在1968年和1971年至1975年间在尼日利亚人体内分离得到ZIKV, 血清学调查发现, 40%尼日利亚人ZIKV血清抗体为阳性。该病毒的活动一直比较隐秘, 仅存在于赤道周围的非洲、美洲、亚洲和太平洋地区[2]。2015年和2016年, ZIKV在巴西引起了疫情, WHO将该病毒列为国际紧急卫生事件[3]。迄今为止, 还没有防治ZIKV的有效方法, 因此迫切地需要开发防治ZKIV的疫苗。

ZIKV属于黄病毒科黄病毒属, 与所有黄病毒科成员一样含有单股正链RNA基因组, 其功能如同mRNA, 编码病毒聚蛋白。该病毒编码的多聚蛋白与其他黄病毒科成员一样, 可以在宿主细胞蛋白酶和自身的非结构蛋白作用下裂解成为3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。7个非结构蛋白参与病毒的复制和后期病毒粒子的组装, 而其结构蛋白可以在宿主细胞因子的作用下包装成为成熟的病毒粒子[4]。

当ZIKV入侵宿主细胞时, E蛋白与细胞表面的受体结合诱导病毒粒子包膜与细胞膜融合, 通过受体介导的内吞作用(receptor-mediated endocytosis, RMF)使核衣壳进入细胞质[5]。ZIKV的RNA完成复制以后, 在宿主细胞内质网附近被衣壳蛋白C包绕形成核衣壳。研究发现, 黄病毒衣壳蛋白C的N端有一段信号肽序列, 可以识别病毒的RNA, 使衣壳蛋白C形成二聚体, 最终组装成核衣壳[6]。然而, 黄病毒核衣壳形成的具体机理还不太清楚。随后, 核衣壳可能通过芽生方式获得包膜, 与prM和E蛋白在内质网内组装成未成熟的病毒粒子。未成熟的病毒粒子警报外分泌途径装运, 在高尔基体外侧网状结构的低pH值条件下, prM被弗林蛋白酶裂解成为M蛋白, 使包膜蛋白发生重排, 形成具有感染性的病毒粒子[7]。

根据GenBank数据库登录号为KU321639基因组序列, 下载包括ZKIV的prM和E蛋白氨基酸序列, 同时下载登革热1型病毒(dengue virus 1, DENV-1)、登革热2型病毒(dengue virus 2, DENV-2)、登革热3型病毒(dengue virus 3, DENV-3)、登革热4型病毒(dengue virus 4, DENV-4)和日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的prM和E蛋白氨基酸序列。通过DNAStar的MegAlign软件比对发现, 在ZIKV的E蛋白的C端存在着两段比较保守区域, 分别位于338-358和463-473区段(见图2)。DENV研究发现, 黄病毒科的prM-E蛋白结构相似, 在膜蛋白的C端都存在有α 螺旋结构(M-H、E-H1和E-H2)和跨膜结构区(M-T1、M-T2、E-T1、E-T2), E蛋白的E-H1和E-H2之间存在着一段整个黄病毒科成员都比较保守的结构区(LGDTAWDFGS)(见图1、图2和图3)[8]。E蛋白的N端含有3个球蛋白结构域(EDⅠ 、EDⅡ 和EDШ ), 参与ZIKV的分子识别, EDⅠ 和EDШ 直接存在一端比较保守的区域[9]。

使用DNAStar的Protean软件对prM和E蛋白进行分析发现, prM蛋白130-145和150-170区间, M蛋白的460-475和405-500区间各存在两个比较明显的疏水性区域, 该区段可能存在两个疏水的跨膜结构区域。而在prM蛋白的85-130区间, E蛋白的330-460区间可能有着明显的α 螺旋结构域。通过ExPASy的Phobius软件进一步对prM和E蛋白序列分析发现, 在prM和E蛋白的C端各存在两个跨膜结构域, 与Protean的预测结果相似。综合以上的分析结果可以预测在ZIKV的prM-E蛋白中存在着黄热病毒prM-E蛋白所特有的特征。

因而, 可以预测包膜蛋白E是ZIKV的主要包膜糖蛋白, 含有多种B细胞和T细胞抗原表位, 是ZIKV的主要保护性抗原。此外, 包膜蛋白E还可能参与ZIKV入侵宿主细胞、膜融合、诱导中和抗体、红细胞凝集等生物学功能。EDⅠ 由位于E蛋白单体中心区域的β 结构组成, 其一端与指样结构的EDⅡ 相连接, 而EDШ 是IgG免疫球蛋白样结构区, 能够诱导中和抗体, 是主要的抗原区域。此外, EDⅠ 和EDШ 直接的连接区域可以形成不规则的结构, 可能与病毒粒子的包装有关[10]。黄病毒E蛋白的N-糖基化位点与病毒的感染力和组装密切相关, 序列分析发现ZIKV的E蛋白Asn-154属于糖基化的位点[11]。Oumar等对已鉴定的ZIKV病毒序列进行多序列分析发现, ZIKV的MR766株的E蛋白上没有该糖基化位点, 这可能与该毒株感染伊蚊有关, 直接影响了该毒株的地方流行性[12]。

prM和E蛋白的跨膜结构区(M-T1和M-T2、E-T1和E-T2)可在细胞膜内形成反向平行结构, 而且α 螺旋结构(M-H、E-H1和E-H2)平行分布于脂质双分子层外侧, 中和M、E蛋白与磷脂双分子层之间的静电排斥力, 稳定M和E蛋白组装成病毒粒子。此外, E-T1具有膜定位作用, 是E蛋白形成VLP必要的条件, E-T2是NS1的作用信号肽, 利于E蛋白形成VLP, 而E-H2可以稳定prM-E异物二聚体结构。在衣壳蛋白C和包膜蛋白prM连接处存在着两个切割位点, 与登革热病毒相似, 位于胞质侧的prM信号肽可以通过NS2B/NS3的切割激活, 位于内质网腔侧的信号肽可以被宿主细胞酶识别切割。在缺少衣壳蛋白C时, prM难以正确定位于内质网, 位于胞质侧的信号肽序列无法正确地被切割[13]。

病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)是由病毒的一个或多个结构蛋白的多个拷贝按照一定的方式排列, 通过自我组装的方式形成的不含有感染力的, 与病毒粒子相似的颗粒样物质。VLPs不含病毒基因组, 因此不具有感染能力, 但是它几乎含有病毒所有的抗原表位, 能够顺利的进入宿主细胞内, 模仿病毒产生自然感染的免疫能力[14, 15]。其次, VLPs作为疫苗的安全性和保护率高于目前的所使用的灭活疫苗和弱毒疫苗, 这些优点使得VLPs是目前为止最具有优势的候选疫苗。目前有多重病毒的VLPs得到了很好的研究, 如口蹄疫病毒[16]、猪圆环病毒[17]、人类免疫缺陷病毒[18]、人乳头瘤病毒[19]、登革热病毒等[20]。

目前黄病毒科的登革热病毒空衣壳的研究比较透彻, 包膜蛋白prM和E共表达时可以形成病毒样颗粒VLP。而然, 在登革热2型病毒VLP表达过程中发现, 其E蛋白的Stem-achor结构含有较强的内质网滞留信号, 阻碍了分泌型VLP的形成。E蛋白的Stem-achor结构位于其C端的20%, 该结构区包括E-H1、E-H2、E-T1、E-T2区域。研究者将登革热2型病毒E蛋白的Stem-achor结构用日本乙型脑炎病毒E蛋白的Stem-achor结构替代, 在VLP表达过程检测到了分泌型的VLP。该结果表明, 日本乙型脑病毒的Stem-achor结构的内质网滞留信号比较弱, 可形成分泌型的VLP。然而, 用日本乙型脑炎病毒E蛋白的Stem-achor结构替代登革热4型病毒E蛋白的Stem-achor结构, 登革热4型病毒的分泌型VLP有所降低, 这可能与黄病毒的跨膜结构有关。但是, 在登革热2型病毒自然感染过程可以形成成熟的病毒粒子, 这可能与C蛋白的结构功能有关, 具体原理还不清楚[21, 22, 23]。Devid等对登革热2型病毒E蛋白的Stem-achor结构进行了定点突变, 发现I407L、M410A、M421L可以增加E蛋白二聚体的疏水性和灵活性, 大大地增加了VLP的分泌[8]。

腺病毒感染的宿主细胞范围比较广泛, 其感染后可以在体内产生较高的抗体滴, 因而重组腺病毒载体是十分理想的活载体疫苗。复制缺陷型腺病毒载体可以包装、表达较大的外源抗原蛋白, 且外源基因不能再接种体内复制, 具有较高的安全性。相比较于裸质粒DNA和痘病毒载体, 重组腺病毒载体所引起的机体免疫反应较强, 已被广泛用于研制口蹄疫病毒[16]、流感病毒[24]、疟疾的疫苗[25]。然而, 是否能够利用复制缺陷型腺病毒表达ZIKV的VLPs需要进一步的试验分析。

ZIKV病毒的组装发生在内质网内, C和prM之间的信号肽序列可以指导prM蛋白正确地定位于内质网上, 从而被病毒的NS2B/NS3蛋白酶和宿主细胞的信号肽酶切割。在单独表达ZIKV的prM蛋白和E蛋白时, 需要在prM蛋白前加一段信号肽序列。根据文献报道选择一段来源于乙型脑炎病毒C末端的信号肽序列MGKRSAGSIMWLASLAVVIACAGA, 通过软件分析发现该序列可以作为ZKIV的prM的有效信号肽, 切割位点可能位于信号肽和prM之间。

ZIKV的E蛋白拥有与登革热病毒E蛋白相似的结构, 其410L和421M与登革热病毒E蛋白一样, 但是其407A与日本乙型脑炎病毒E蛋白相似。寨卡病毒的E蛋白C端是否具有强的内质网滞留信号, prM和E蛋白表达后是否能够形成分泌型的VLP, E蛋白Stem-achor结构被日本乙型脑炎病毒替代后VLP分泌量是否会增加还不清楚, 需要进一步的实验来证明。

The authors have declared that no competing interests exist.