【求助】细菌转化后涂板，长出的细菌一块一块的，不成单菌落。［问题很有代表性，新手

#【求助】细菌转化后涂板，长出的细菌一块一块的，不成单菌落。［问题很有代表性，新手| 来源: 网络整理| 查看: 265

JM109转化后，摇培45分钟后，取200ul涂板，很仔细涂匀，但是第二天，细菌去长成一块一块的，不形成单菌落，不知道是什么原因？请教各位。不可能是没涂开，我仔细涂的，看清楚了的。是不是菌液加多了，放在培养箱中，不平，流到一边，后形成这样呢？请教各人，有没有遇到跟我相似经历的。谢谢了。我感觉是涂多了，如果转化效率高，50ul足以。另外，涂完后最好把板子吹干后再放到培养箱。平板是不是有问题了啊!fantian_dc wrote:涂完后最好把板子吹干后再放到培养箱。平板有什么问题吗？平板没什么问题。涂完后发现平板上水淋淋的，一倾斜，菌液就流到低的一连去了。估计是这个问题吗？如何吹干呀？涂板前把板子正置37度温箱烤烤，就是转化完摇菌恢复抗性的这段时间。涂板时少加点菌液，很快就干了，最好打开超净台的吹风机。JM109浓度太大，使得你的200微升的涂板液含菌量大，我昨天就是这个现象，和你说得一样。改菌液就好了，长得很均匀。你用多少菌液呀？150ul菌液吗？估计感受态菌太多了，还有连接转化效率很高，应该做下阳性对照，控制下感受态菌量．长的太多就做个阴性对照，试试你的没有转化质粒的感受态在抗性平板上是否也可以长出来，感受态的转化效率再高，即便是电转化也不会长成一片一片的！我最近取以前冻存的菌液做转化试验，但是长出来的平板是一块一块的，不知道是什么原因？是不是跟你的一样？再请高手们指教一下。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=304 height=172 title="Click to view full 未命名.jpg (304 X 172)" border=0 align=absmiddle>我最近也老是出现一抹一样的情况。以下我的两个做法完全一样，但一个感受态是用氯化钙做的很简单的那种，而且制感受态的时候还是随便弄了下，还有个是超级感受态，制的时候非常严格小心，结果，超级感受态就成了这样，氯化钙的就较正常，但是出现了很多卫星菌落，就是长出来很小很小一大块连到一起了，不知道何故？要么就是连到一起，没有蓝斑（正常是有蓝斑的），没有单菌落。本人也是如此，正在发愁中，高人在否？指点一下。可能是菌液涂得太多了，我以前也是的，可以适当减少再试试看．我刚涂完平板后也会出现一点点这样的情况，有人说是感受态死菌的尸体。但第二天平板上也能长出我要的菌，只是有时候长的少，有时候长的多。我也搞不清楚。从楼上几位的描述和图片，我考虑以下可能：一是铺板时菌液浓度过大，尤其是超级感受态，转化效率比较高，如果铺板时细菌浓度过高确实容易出现成片菌落，如果只是一般克隆的话，不需要太高密度

二是抗生素失效，楼上发的图并不是很清楚。以前我见过铺板出的菌膜，也就是满板细菌，只不过有的地方厚有的地方薄。另外一位战友还提到出现卫星菌落，这些都是抗生素失效的表象，尤其是大家未提到阴性对照，因此也值得考虑（当然其中很多人可能并不是这个原因）解决的办法是注意选择正确的抗生素，制备培养板时待培养基温度约为60度（略微烫手）时再加入抗生素。

elizabirth wrote:我最近取以前冻存的菌液做转化试验，但是长出来的平板是一块一块的，不知道是什么原因？是不是跟你的一样？再请高手们指教一下。抗生素失效youarewelcome wrote:可能是菌液涂得太多了，我以前也是的，可以适当减少再试试看．再减少也是如此有时候也遇到这样的问题，说点我的看法：1。首先考虑涂量的问题了，有时候大家可能有这样的经验，涂900ul就满板都是，像挺粘的东西涂不开似的，第二天就可能长不出菌了。我一般是一个100ul，一个900ul。正常来说应该是没有什么问题的了。当然，如果是比较严谨的人，可以估算一下最后能长几个菌，比如说起始连接量是多少，连接效率大概有多少，感受态细胞效率有多少，这样是大概能估计出长菌量的。然后就照着长100--1000个菌的量涂平板。2。和感受态有很大关系。呵呵，感觉上BL21,DH10B容易出现这样的情况，电转比热转容易出现。也需要考虑感受态细胞的浓度和在操作过程中是否使细胞死亡了。最好的方法就是用商品化的感受态了。3。和连接样品的关系是最大的，很可能同时几个转化，其他的都挺好，就有一个是这样的。而且，越是不好连接的样品，出现的几率越大。所以，载体和片段的处理应更严谨些，连接酶和连接体系的确定也应更稳妥些。有时候变换转化的方法也是可行的，热转不出换电转看看，电转不好换热转看看，因为感受细胞是不一样的，而且电转之前会有精制的步骤。4。平板的抗生素是绝对要考虑的，不光是楼上说的作平板时要在60度以下家抗生素。如果菌落浓度过大，菌的周围会产生氨苄的抗性，所以就会产生非常小的菌落，有点像卫星菌，其实都是杂菌。还有，如果蓝白筛选的时候出现这样的问题，需要考虑IPTG诱导表达产生毒性蛋白，所以，可以试一试就加AMP的，多检几个菌就行了，呵呵。5。如果就是出现这样的情况，那就不妨在另外平板上划线试一试吧，很可能可以挑出单菌落的。仅供参考。我做了蓝白筛选,在一个蓝班的旁边会产生一点点的小的白班,这是多数情况,有时在一个白班旁边长出一群白班,都不知道是咋回事,而且每次的菌都要长一天多才出来,出来的菌落也挺小的,周围还有一点点的菌,挑单菌落的时候都很难挑,希望高手指点!aries123 wrote:我做了蓝白筛选,在一个蓝班的旁边会产生一点点的小的白班,这是多数情况,有时在一个白班旁边长出一群白班,都不知道是咋回事,而且每次的菌都要长一天多才出来,出来的菌落也挺小的,周围还有一点点的菌,挑单菌落的时候都很难挑,希望高手指点!传说中的卫星菌落: ) 转化子菌落表达的beta内酰胺酶分泌到菌落周围使周围的抗生素失效

至于楼主的问题,除了以上站友回答的方面涂完后发现平板上水淋淋的，一倾斜，菌液就流到低的一连去了。估计是这个问题吗?是!!涂布之后一定要等菌液干了再放进温箱.可以在超净台吹干,很快的.

建议初学者勤学好问,多请教师兄,很多小问题本不是问题的.我同学说他们实验室(全国顶尖的大学)一个保送的硕士研究生号称本科做过实验,而且在看过别人操作以后, 涂平板把菌液加到培养皿盖子上然后开涂...-_-!

长出菌斑应该是抗生素失效了。如果是菌太多了，长出来的还是单克隆，只不过就是不均匀而已。以上的问题都考虑过了，不过也没能解决问题。同时用另一个人的菌做的感受态，转同一个质粒，涂同样的量，用同一次配制的平板，做出来的结果就是很好的菌落图（共做了三块板，都是好的），而我的菌做出来的，就是上图所示的，所以我们估计是细菌的问题，现在我想问的就是：为什么细菌会出现这样的问题呢？该怎么处理才能让细菌恢复正常呢？那应该怎样避免这种传说中的卫星菌落呀,我以前做没有的,但最近做就有了,操作都一样的~~~~~~~唉，看来这小问题还真是难住大家了楼上说哪些卫星菌落是杂菌，有点疑问就是我转化完后，出来的菌落也是一块一块的，但是我挑那些小点菌落，验证完也都是阳性克隆子。什么，不明白怎么不明白呀？我觉得是死菌的可能性较大，重新换个细菌后就好了。可能是你的感受态浓度有些大吧我上次做也出现了楼主说的情况，我老板看后，说是因为菌液浓度太大了，所以你涂板的时候要将菌液稀释成一定浓度，之后再涂，不妨试试！要防止卫星菌的出现，可能一种方法可行，那就是从培养箱拿出来后及时放进4度冰箱，要用时才把它拿出来，不用时就把它放回4度冰箱，不要把它放在室温太久，我的感觉是氨苄的如果从上午放到下午那就长卫星菌了。我试过涂得少一点的情况，涂少了之后，就什么也不长了。没有高人出来讨论了？我们实验室也出现过类似的情况。但有不具有重复性，我们也是比较厅怪。总结之后我认为有是以下一个或多个因素共同作用的结果：其一，抗生素失效，配制平板时温度太高这是一个常见原因；其二，Host cell变异或污染，你所谓的JM109可能在你的传代过程中，多次传代后已物是菌非了。经常我发现一些研究生拿着一管JM109在实验室可以从年头用到年尾。强烈建议应将HOST CELL多管分装冻存后，每次取一份用完之后就弃之。其三，平板制作的工艺：水份大多，我有一个经验，制备好的或在冰箱中保存一段时间的平板，取出后置超净台朝上放置并打开一半上盖后吹干至少两小时，当然别忘了开超净台的风机和紫外灯。其四，虽然几乎所有的书本介绍说感受态细胞都可以长期冻存。事实上也是，从正规公司买回来制备好的感受态细胞长期冻存没有问题，而我们实验室研究生自已制备的感受态细胞能长期冻存的不过20%，因此建议现炒现卖。仅为个人经验。个人认为出现楼主所说的情况的最大可能性是上述第二个possibility。

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