干货丨数字PCR技术、应用、市场发展梳理

在全球医疗器械行业中，体外诊断是占比最高的细分领域之一，根据诊断原理的不同，体外诊断产品分为分子诊断、免疫诊断、生化诊断等多种类型。其中，分子诊断的灵敏度、特异性、准确性等均较为突出，尤其是在新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下，以PCR为代表的分子诊断技术得到了加速发展。

与第一、二代PCR技术相比，数字PCR具有很多优势：一是特异性、灵敏性均有显著提高；二是在不依赖内参和标准曲线的前提下，可直接得到绝对量化指标；三是微反应单元相互独立、封闭，避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰，准确度和可重复性较高。

表1 三代核酸检测技术对比

技术方法

概念

技术优势

技术劣势

传统PCR

采用普通PCR扩增仪扩增靶基因，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析

★可实现特定核酸片段的体外复制

★ 相关核酸染料对操作人员和环境具有危害

★易出现假阳性结果

★耗时时间长、操作复杂

★无法准确定量

荧光定量PCR

是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

★污染风险低

★操作流程更简单、经济高效

★样品加样量少

★不同厂家生产的试剂和设备之间的差异对检测结果影响较大，不具备可比性

★存在背景值的影响，结果易产生偏差

★低拷贝的DNA难以检测

★受PCR抑制物的影响较大

数字PCR

将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元（纳升级）中，部分反应单元包含靶标分子（阳性），而其他不包含（阴性），接着进行扩增，并利用TaqMan化学试剂或染料标记探针检测靶标序列，能够实现靶标分子的绝对计数。

★特异性强、灵敏度高

★ 绝对定量，准确性好

★抗干扰能力强

★ 因需要对反应体系进行拆分和分配，因而对模板量要求高，过多会导至无法定量，过少会导至信号过低。

★对引物的特异性要求高

（数据来源：华安证券研究所研报、公开信息整理）

PCR技术诞生后迅速在感染性疾病诊断、病毒监测、无创产检甚至犯罪侦查等领域得到了广泛的运用。

（一）实现感染性疾病早期高效检测——以新冠病毒为例

一是病毒检测；第二代荧光定量PCR检测技术是目前新冠病毒检测的“金标准”，但由于病毒探针结合位点突变、样本病毒载量不足等原因，在临床检测过程中经常出现假阴性结果，由于数字PCR具有更高的灵敏度、精准度，以及其适合痕量样本检测的特性，能够检测出荧光定量PCR检测过程中错过的感染，可作为后者的补充。

二是临床样本病毒载量评估；在人群筛查及临床诊疗中，为科学选取采样方式，需要评估不同临床样本病毒载量，如鼻咽拭子、血尿、粪便、肺泡灌洗液等，由于数字PCR可提供绝对量化指标，为采样方法的选取提供了参考，从而提高检出率。

三是监测环境病毒载量；在外防输入的战略要求下，环境病毒检测工作尤为重要，此前的散发疫情，很多因都是国外进口物品附有新冠病毒引起的。数字PCR可对低核酸丰度样本进行有效检测，包括从不同环境中取样的样本，如病房、医院卫生间、实验室等等，在疫情防控中起到了不可忽视的作用。此外，数字PCR的应用场景还有病程不同阶段的病毒载量评估、核酸参考品制备、抗病毒药物研发等环节。

（二）助力癌症液体活检——实现患者全病程监控

液体活检是普通癌症检测的延伸和补充方法，将目标采取样本从组织延伸到血液、体液。数字PCR可精确检测转移到血液循环中的肿瘤细胞和DNA片段，提供基因突变情况等信息，动态监控病人病程的发展，从而为伴随诊断和个性化治疗提供可靠依据

除上述场景外，数字PCR技术还有望在二代测序文库质控和结果验证、胎儿疾病筛查、环境及食品检测等领域，成为第一、二代PCR技术的重要补充手段，本文不再赘述。

自2006年，Fluidigm公司推出第一个商业化的基于芯片的dPCR仪以来，数字PCR仪不断实现创新和突破。在稀释方式上，主要的是伯乐为代表的液滴式、以Fluidigm、赛默飞为代表的芯片式和罗氏、凯杰为代表的微板式。

国外dPCR主要是三个模块组成的一体机，而国内大多还是几台仪器分别完成样本分区、扩增和数据读取。新冠疫情下，dPCR生产商无不在产品上实现突破，近年来新品频出，直有问鼎分子诊断之势。

Bio-Rad 

伯乐

图1 伯乐QX ONE ddPCR系统

拥有二十多年PCR仪研发、生产经验的伯乐公司是全球dPCR市场的领跑者。伯乐于2011年斥资1.62亿美元，完成对QuantaLife公司的收购，正式进军dPCR市场，随即推出QX100、QX200微滴式数字PCR系统以及最新的QX One集成液滴数字系统。

2017年，伯乐又收购了ddPCR系统制造商RainDance Technologies，该公司拥有在短时间内生成数百万个皮升级微液滴的核心技术，可将伯乐原液滴数提升250-500倍。两者的融合进一步稳固了伯乐在dPCR领域的领军地位。

根据2019年财报，伯乐销售额收入超23亿美元，ddPCR增长强劲。2020年，Bio-Rad发布了全球首款数字PCR一体机：Bio-Rad的 QX ONE ddPCR系统，整合了微滴生成、热循环反应及微滴读取等步骤，最大程度减少人工操作，提高了检测通量。配备四个独立的荧光通道，结合ddPCR特有的高阶多重PCR技术，可以在单反应孔中实现8重拷贝数变异（CNV）检测、5重突变检测或4重基因表达检测。兼容目前QX200 系统中所使用的supermix、assay和kit。

美国FDA近来批准了Bio-Rad实验室开发的基于ddPCR技术的SARS-CoV-2检测的紧急使用授权。

Thermo Fisher Scientific

赛默飞