基因编辑商业化在即，工艺端助力破解三大关键难题

2023年4月10日/医麦客新闻 eMedClub News/--2023年1月，欧洲药品管理局（EMA）受理了CRISPR Therapeutics和Vertex公司递交的关于exa-cel（用于治疗镰状细胞病和β地中海贫血）的上市申请。如果顺利获批，exa-cel有望成为全球首款获批上市的CRISPR基因编辑疗法，这也将大大提高业内对基因编辑的信心。

据方舟投资公司（ARK）发布的《Big Ideas 2023》投研报告预测，2030年基因编辑疗法的年总收入将达到300亿美元，如果将适应症拓展至治疗1型糖尿病，则有望达到600亿美元的规模[1]。整体而言，基因编辑市场未来市场前景可观，增长潜力巨大。

▲ 基因编辑未来市场规模（来源：参考资料1）

基因编辑技术迭代，推动发展新高潮

作为一种富有市场前景的技术，基因编辑的发展也十分迅速，在短短几十年内就已经经历了锌指核酸酶（ZFN）技术、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术、CRISPR/Cas9技术的迭代升级。

▲ 3种基因编辑技术（来源：参考资料2）

ZFN由锌指蛋白（ZFP）和Fok I内切酶结构域组成，其修复方式多样，对基因表达强度影响较小，同时也存在“可编辑性”较低、设计与筛选复杂、成本较高、专利封锁等诸多不足。TALEN技术作为第二代基因编辑技术在结构上与ZFNs类似，但相比于ZFNs，TALEN的特异性更高，且还具有毒性更低、构建更容易等优点。

2012年，CRISPR/Cas9技术开始应用，其主要由单链向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白所组成，在sgRNA的向导作用下，Cas9蛋白可对不同靶部位进行切割，所切割序列靠近靶基因上的邻近预先间隔区域（PAM），能够更加便捷地进行基因编辑。相较于第一、二代技术而言，CRISPR/Cas9技术在安全性、靶向效率、成本等多方面都得到了提升，已成为当下的主流技术。

而基于CRISPR/Cas9技术的研究，单碱基基因编辑（BE）技术、引导编辑（PE）技术相继诞生，再次将基因编辑推向了新的发展高潮。

基因编辑赛道玩家及三大挑战

随着基因编辑技术的优化升级，其应用潜力得到进一步提升，吸引了众多国内外创新药企入局。目前，这一赛道上国外整体进展较快，最快的即将步入商业化阶段；国内整体尚处于临床早期及临床前阶段，布局企业超10家。其中，博雅辑因、邦耀生物、瑞风生物针对β地贫的基因编辑候选产品均已进入1期临床。此外，基因编辑技术还被广泛用于开发通用型CAR-T疗法、修饰干细胞疗法等，在罕见病、肿瘤、感染性疾病等诸多领域均有应用。

▲ 国内外基因编辑赛道主要企业（来源：医麦客整理）

在研基因编辑疗法的适应症主要在罕见病领域，所采用的技术以第三代CRISPR/Cas9技术为主。同时，不少企业在此技术基础上进行了不同方面优化升级，可以看出不断优化开发基因编辑技术并将之真正应用于临床直到上市惠及患者是当下涉及这一技术的创新药企的共同目标。

然而，实现这一共同目标之路并不顺利。在2022年，全球首个接受CRISPR基因编辑疗法的DMD患者Terry在治疗过程中死亡。尽管死因尚未公布，但这引发了业内外对基因编辑技术的担忧。同时，这也意味着基因编辑疗法尚有诸多待改进的环节，以提升疗效和安全性，从而开辟新的前进道路。

目前，序列及靶点的优化、递送技术、安全性问题仍是基因编辑技术的三大重要挑战。

序列及靶点的优化

Cas9酶需要与sgRNA形成复合物，并在sgRNA与目标序列结合的引导才能进行基因编辑，故而基因编辑的首要任务就是设计一个合适的sgRNA。sgRNA由一个能够与目标DNA互补配对的核苷酸序列crRNA和一个能够帮助Cas核酸酶折叠的tracr RNA，其中，可定制的crRNA可以根据目标而实现特异性。设计sgRNA需要从提升靶向活性、减少sgRNA脱靶效应、提升编辑效率等方面去优化，在尽量使得sgRNA只与目标DNA互补配对的同时提升效率。目前，已经开发出了用于sgRNA设计的工具，如CRISPick、GPP sgRNA Designer、CHOPCHOP等。

此外，寻找可成药且有效的靶点也是药物研发阶段的重要挑战之一。CRISPR/Cas9文库筛选可以用于发现潜在的药物靶点，其主要有混合文库和阵列文库两种形式。其中，混合文库是通过慢病毒转导将待筛选sgRNA表达载体库整合到Cas9表达细胞系，进行阳性或阴性筛选后通过高通量测序获得结果，具有成本低、耗时少等优点。

不同于混合文库，阵列文库是将每个基因的sgRNA分别列于芯片或多孔板中进行处理扩增，每孔中只敲除一个基因，且能借助自动化工具更加精确地筛选出目标基因。相较于混合文库而言，阵列文库筛选的基因型与表型的相关性更加直接，在终点功能分析中更具灵活性，已经被广泛应用于药物的开发。

递送技术

决定基因编辑成败的一个重要因素是能否将CRISPR/Cas9工具递送至细胞中，常用的递送方式可以分为病毒载体递送（如AAV、慢病毒、腺病毒等）和非病毒载体递送（如电穿孔、显微注射、LNP等）。由于病毒载体可能存在插入诱变、免疫应答等潜在风险且生产成本较高，故而安全性更高、成本更低的非病毒载体技术正被探索用于递送基因编辑工具。

其中，电穿孔法利用高压电流脉冲，允许RNP通过细胞膜上产生的瞬间的纳米级孔隙进入细胞，具有较高的效率和瞬时的稳定转染。对于如免疫细胞、多能干细胞、原代细胞等难以转染的细胞而言，传统的递送手段可能会导致细胞毒性，而已有研究证明了RNP电穿孔可以有效地将Cas9 RNP递送到难以转染的细胞中。相较于病毒递送而言，RNP电穿孔技术能够更加精准地控制给药时间，降低脱靶效应，提高编辑效率的同时避免了质粒整合问题，是一种更为理想的递送技术。

此外，在mRNA递送中崭露头角的LNP技术也被探索用于递送基因编辑工具，但其存在递送效率受细胞类型的限制，目前用于CRISPR/Cas9递送新型合成材料载体还在进一步研发中。

安全性问题

安全性问题是当下基因编辑技术发展需要解决的重要挑战之一。sgRNA序列识别并不是绝对的，当其错配会造成脱靶效应，从而导致染色体重排，基因组造成损伤等问题。在生物研究和临床研究中，意料外的编辑会引发双链断裂触发细胞凋亡，甚至有致癌的风险。此外，基因编辑工具在体内长时间表达有可能导致脱靶效应累积，或者诱导免疫系统排斥反应。

基因编辑技术发展至今时间并不算长，我们对CRISPR/Cas9基因编辑技术的安全风险及相关机制的认识仍有待加深，其安全性尚需更多的临床数据证明。当下，无论是业内还是监管机构都对基因编辑技术持谨慎态度，2022年5月CDE发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中有11处提到基因编辑，7处直接提到CRISPR-Cas。这一指导原则写明了各界对基于酶的基因编辑技术的风险认知较为有限，当前的研究方法对编辑或剪切效果的分析仍存在一定的局限性，在使用基因编辑技术时应考虑靶向特异性和脱靶引起的安全性风险。这也意味着在提升基因编辑安全性方面，还需要进行全面优化。

优化之路漫漫，高精工具助力事半功倍

基因编辑技术的优化是一条漫长的路，且面临着大量繁琐又复杂的工作，往往需要耗费大量的时间、人力和资金，而借助高效、便捷、精准的工具能够起到“事半功倍”的效果。当下借助高精工具进行研发和优化已逐渐成为一个趋势，Jennifer lab等都已利用Nucleofector技术开展CRISPR相关的研究。Lonza 4D-NucleofectorTM利用模块化设计，通过不同模块的组合适用于不同的应用场景，助力基因编辑技术的优化，满足优化过程中的不同需求。

Lonza 4D-NucleofectorTM96孔电转模块可以直接与核心模块连接，每块板最多可运行96个独立程序，5分钟内即可完成自动处理，达到优化核转染条件或中高通量筛选的目的，在转染难以转染细胞，测试建立实验的多个条件，筛选cDNA、RNAi、CRISPR、TCR文库，转化细节等多种场景下均适用。在不同的4D-NucleofectorTM模块中，可满足在相同已优化的电转条件下实现不同细胞通量的需求。此外，这一模块能够无缝集成到自动化液体处理环境中。

▲ Lonza 4D-NucleofectorTM96孔电转模块

另一款创新药高通量研发工具Lonza 384孔NucleofectorTM系统可以用于384孔格式的高通量核转染，可以在20ul体系实现高通量筛选目的，甚至可以低至10ul低至10ul体系，减少样本的消耗。作为一个独立的平台，可以在1分钟左右完成384个样本的电转，适合应用于需要最大重现性的筛选。并且，这一工具可以使用现有的96孔ShuttleTM电转实验方案，易于操作。其直观的PC软件操作，可无缝集成到自动化液体处理环境中。

▲ Lonza 384孔NucleofectorTM系统

整体而言，这两个模块的均为基因编辑技术优化提供了更加便捷、高效、精确的手段：

Lonza 4D-NucleofectorTM96孔模块：可使用现有的96-well电转实验方案或参考X-unit 20uL体系电转实验方案和导电聚合物96孔NucleocuvetteTM板。

Lonza 384孔NucleofectorTM系统：384孔NucleofectorTM试剂盒使用现有的966孔ShuttleTM电转实验方案和导电聚合物384孔NucleocuvetteTM板。

此外，Lonza Knowledge Center中的Cell&Transfection Database提供了特定细胞类型的优化方案或建议，指出了经过内部测试的核转染条件，并分享了其在处理特定细胞类型方面的经验和知识，全方位助力基因编辑的优化。目前，Lonza 4D-NucleofectorTM96孔电转模块及Lonza 384孔NucleofectorTM系统均已经在众多创新企业的基因编辑研发中广泛应用，如GSK[9]、AZ[5]、Takeda[6]、巴斯德研究所[7]、加州大学[8]等。

拾级而上，终可拿云

国内基因编辑赛道整体尚处于早期研发阶段，近年来发展速度越来越快，与此同时基因编辑赛道的产业链也在逐渐完善，为基因编辑技术的研发及优化提供了更多选择，精准高效的工具助力企业“快人一步”。未来，在技术、政策、资金等诸多因素的共同推动之下，基因编辑技术将会更上一个台阶。

参考资料：

1.《ARK Invest 2023 Big Ideas投研报告》

2.德邦证券行研

3.各公司企业官网

4.JING Yao-Bin, WANG Wei, ZHANG Wei-Qi, LIU Guang-Hui. Genome-scale CRISPR/Cas9 screen: a powerful tool for life science studies. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2018, 30(9): 994-1002.（DOI: 10.13376/j.cbls/2018119.）

5.Dickson,Anna et al.“Highly scalable arrayed CRISPR mediated gene silencing in primary lung small airway epithelial cells.”SLAS discovery:advancing life sciences R & D vol. 28,2 (2023): 29-35. doi:10.1016/j.slasd.2023.01.003

6.Yu, Shan et al. “Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells.” ACS chemical biology vol. 17,4 (2022): 918-929. doi:10.1021/acschembio.2c00006

7.Mac Kain, Alice et al. “Identification of DAXX as a restriction factor of SARS-CoV-2 through a CRISPR/Cas9 screen.” Nature communications vol. 13,1 2442. 4 May. 2022, doi:10.1038/s41467-022-30134-9

8.Gordon, David E et al. “Comparative host-coronavirus protein interaction networks reveal pan-viral disease mechanisms.” Science (New York, N.Y.) vol. 370,6521 (2020): eabe9403. doi:10.1126/science.abe9403

9.A 384-well workflow to execute an arrayed CRISPR-Cas9 Gene Editing screen in T-cells（https://myeventflo.com）