多聚谷氨酰胺延伸蛋白募集细胞内正常蛋白质或RNA的分子机制

人类编码蛋白质的基因中三核苷酸重复序列的异常延伸是引发多种神经系统疾病的重要原因[1]，其中CAG三核苷酸重复序列的异常延伸所引发的神经退行性疾病是重要的一类.CAG所编码的氨基酸是谷氨酰胺(glutamine，Gln，Q)，这种突变会导致其产物蛋白质中含有一段异常延伸的多聚谷氨酰胺(polyglutamione，polyQ)重复序列即PolyQ序列，因此，通常将这种类型的疾病称为PolyQ疾病.目前为止，已经鉴定出的PolyQ疾病大约有9种，包括亨廷顿病(HD)、脊髓小脑共济失调(SCA1、2、3、6、7和17)、脊髓延髓性肌肉萎缩(SBMA)和齿状核红核苍白球丘脑下部肌肉萎缩(DRPLA)等[2].这9种PolyQ疾病分别由不同致病基因的CAG序列异常延伸突变导致(表 1)，这些基因所编码的蛋白质的结构和功能也各不相同.不同类型的PolyQ疾病中，受到影响的神经元类群有所差异，所引发的神经退行性病变的临床症状也不尽相同[3].

虽然不同PolyQ疾病的突变基因以及受影响的神经元类群等有所差异，但是这些PolyQ疾病在致病机理上具有一些相同的特征.在细胞水平上，疾病都能够引起泛素-蛋白酶体功能的损伤、转录调控紊乱、神经细胞轴突运输受损以及线粒体功能损伤等等[4].而在分子水平上，PolyQ序列的异常延伸使蛋白质容易发生积聚，形成不可溶的淀粉样沉淀[5].在细胞内可以观察到突变的PolyQ蛋白大量积聚并且形成微米级别大小的包涵体结构.包涵体的形成是大部分神经退行性疾病的一个共同特征.除了PolyQ蛋白形成的包涵体以外，在其他类型的神经退行性疾病中也都检测到了类似结构，如帕金森病(PD)中的路易氏小体(Lewy bodies)[6]、肌萎缩侧索硬化(ALS)中的TDP-43包涵体[7]等.关于包涵体在神经退行性病变中的作用，目前还存在争议.有观点认为包涵体的形成是对神经细胞的保护作用的体现[8]；而另外一种观点则认为，包涵体的形成会引起神经细胞毒性，对细胞造成损伤.

研究发现，在包涵体中除了能够检测到致病蛋白质以外，还发现了细胞内许多其他重要的组分，包括泛素-蛋白酶体和分子伴侣系统的成分[9]、转录因子[10]以及RNA[11-12]等.因此有学者认为疾病相关蛋白质可以将与其相互作用的其他蛋白质募集到包涵体中，从而引起细胞毒性和神经退行性病变[13].这些不同功能的蛋白质或RNA在细胞的稳态以及各方面功能的行使和调节中扮演着十分重要的角色.包涵体对这些相关蛋白质或者RNA的募集势必会引起细胞相关功能的紊乱，从而引起神经细胞损伤和死亡，导致神经退行性病变.例如，病理研究表明，PolyQ疾病中蛋白质的降解功能受损，包括泛素-蛋白酶体或自噬两大蛋白质降解系统功能损伤等[14].而蛋白质降解功能的损伤不利于对细胞中错误折叠或积聚蛋白的及时和有效地清除，会加剧错误折叠或积聚蛋白的积累，从而加速神经退行性病变.细胞和分子生物学研究表明包涵体可以募集泛素-蛋白酶体组分、分子伴侣蛋白以及一些自噬蛋白等[9].这些组分是细胞内蛋白质质量控制系统中的重要组分，其功能的损伤将直接导致蛋白质清除功能的破坏.积聚蛋白在分子水平上对这些组分的募集，破坏了其正常功能，进而影响整个蛋白质清除机器的正常运转，进一步加剧积聚蛋白的积累，加剧神经退行性病变.同样，积聚蛋白或包涵体也将以同样的方式通过募集细胞内的转录因子、RNA以及线粒体相关组分，引起神经细胞转录调控紊乱以及线粒体功能损伤等.由此可知, PolyQ积聚蛋白的募集作用可以广泛地影响神经细胞在各方面的功能，破坏细胞的内稳态(homeostasis)，引起神经细胞毒性，加剧疾病发展.所以，研究积聚蛋白对这些细胞内相关蛋白质或RNA的募集作用及其分子机制对于认识神经退行性疾病的病理机制十分重要，并且有可能为疾病的治疗和药物的研发提供分子靶标.

我们实验室研究了多种积聚蛋白对细胞内其他组分的募集作用，并且对募集作用分子机制和相关蛋白质功能的变化以及细胞效应做了详细的阐释.我们发现特异的分子间相互作用在蛋白质的募集过程中具有重要的作用，并且提出了挟持模型[15-16].当疾病相关蛋白质在细胞中发生错误折叠和积聚时，其积聚物会将细胞中其他与之相互作用的蛋白质或RNA募集到沉淀物中.这种募集作用不仅改变了这些被“挟持”的蛋白质的细胞定位，还使它们处于可溶状态下的量减少，从而引起其功能活性的损伤(图 1).

蛋白质积聚物对细胞内其他组分的募集作用有些是非特异性的；也有一些募集作用具有特异性，需要分子之间的特异相互作用来介导.根据具体的相互作用模式的特征，我们将蛋白质积聚的募集作用分为4种不同的类型(图 2).具有不同结构域特性的PolyQ蛋白通过一些共同的或者特异的募集作用方式，募集细胞内与其密切相关的蛋白质或RNA.

共积聚指的是容易积聚的蛋白质之间通过淀粉样结构域或序列相互形成富含β折叠的积聚物(图 2a).PolyQ蛋白由于都含有PolyQ序列而容易相互共积聚.当一种蛋白质的PolyQ延伸而发生积聚时，很有可能与和他相关联的正常或突变的PolyQ蛋白共积聚.例如，PolyQ延伸的亨廷顿蛋白(huntingtin，Htt)能够将正常Htt蛋白募集到包涵体中，这很有可能是通过PolyQ序列之间的共积聚效应实现的[17]. PolyQ延伸的Htt、Ataxin-3 (Atx3)以及Ataxin-1 (Atx1)等都可以与含有PolyQ序列的转录因子CBP (CREB-binding protein)共积聚，从而将CBP蛋白募集到包涵体中[18-19].此外，PolyQ蛋白还可以与含有其他类型的淀粉样序列的蛋白质发生共积聚.有文献报道，PolyQ延伸的Htt蛋白可以与普里朊(prion)样蛋白Sup35发生共积聚[20-21].

PolyQ蛋白发生积聚时，可以通过自身特定结构域将与其相互作用的其他蛋白质或RNA募集到包涵体中.我们将此类募集称为特定结构域的相互作用介导的募集作用[22](图 2b).引发9种PolyQ疾病的蛋白质功能和结构域组成各不相同，因此其细胞内的相互作用网络有很大差异(图 3).Htt蛋白是一个由3 144个氨基酸组成的相对分子质量较大的蛋白质，目前关于其结构和功能的了解比较少.在Htt蛋白的PolyQ序列前面有一段脯氨酸丰富区(proline-rich region，PRR)序列，该序列可以与HYPA或HYPB蛋白的WW结构域相互作用，这一相互作用介导了PolyQ延伸的Htt蛋白对HYPA或HYPB的募集，且结构域的突变会破坏蛋白质的相互作用和募集效果[23-24].Ataxin-7 (Atx7)蛋白是细胞核内SAGA复合物的重要组分，参与基因转录的激活过程.与Htt蛋白类似，Atx7蛋白的N端PolyQ序列之后也含有一段PRR序列，该序列可以与SH3结构域相互作用，从而介导相关蛋白质的募集作用[25].我们还发现，Atx7的N端锌指结构域可以与USP22的N端相互作用[16].当PolyQ延伸突变的Atx7蛋白形成包涵体时，Atx7可以通过与USP22蛋白锌指结构域之间的相互作用将USP22募集到包涵体中.由于Atx7蛋白是SAGA复合物的组分，该积聚蛋白募集复合物中的其他组分将导致该复合物的功能活性受到损伤.我们的研究发现，这种募集作用导致USP22对组蛋白的去泛素化功能受到损伤[16].此外，含有PolyQ序列的Atx3蛋白是一种去泛素化酶，其C端UIM结构域可以识别泛素链，负责结合泛素化的底物蛋白.PolyQ延伸的Atx3可以通过UIM结构域将细胞内的泛素化蛋白募集到沉淀中[15].Atx3蛋白的C端还含有一个VBM结构域，该结构域介导Atx3与P97的相互作用[26].PolyQ延伸的Atx3蛋白在积聚过程中也会通过这种相互作用将P97募集到沉淀中[15].Atx3积聚物对P97/VCP蛋白的募集作用影响了P97对细胞内NEDD8修饰水平的下调功能.由此，我们认为，不同的PolyQ蛋白都可以通过其各自特定的结构域或模体所介导的相互作用，将细胞内与其密切联系的其他蛋白质募集到包涵体中.

我们知道，PolyQ蛋白能够发生多种不同的翻译后修饰，包括泛素化修饰、SUMO化修饰和乙酰化修饰等等.这些修饰会影响蛋白质的积聚、包涵体形成及降解等过程.而这些通过共价连接修饰到PolyQ蛋白上的小分子蛋白质或基团，可以作为特异的分子信号，被细胞内特定的结构域识别，从而介导蛋白质之间的相互作用.例如，泛素可以被UBA和UIM等结构域所识别[27]，含有这一类结构域的蛋白质都可能结合泛素.因此，发生共价修饰的PolyQ蛋白在积聚过程中，除了利用自身特异的结构域募集相互作用的蛋白质以外，也可能通过这种小分子蛋白质或基团介导的特定形式的相互作用募集细胞内相关成分(图 2e).

在不同的PolyQ蛋白所形成的包涵体中往往可以检测到泛素、蛋白酶体组分，以及泛素接头蛋白(adaptor) UBQLN1/2和自噬受体P62、OPTN等泛素相关成分[28-30].为什么在不同的突变体蛋白质形成的包涵体中都能检测到这些泛素相关组分一直是个未解之谜.根据我们所提出的募集挟持模型，这些泛素相关的成分很有可能是通过共同的机制，即泛素介导的相互作用而被募集到包涵体中的.

大量的实验证据都表明，PolyQ延伸的蛋白质会被泛素连接酶识别并发生泛素化修饰[31]，从而将这些错误折叠的蛋白质打上标签，被泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体等蛋白质质量控制系统所识别和清除，以维持细胞中的蛋白质稳态[32].例如，泛素连接酶CHIP能够促进多种PolyQ蛋白质包括AR、Htt、Atx1和Atx3的泛素化，抑制突变蛋白的积聚，缓解神经毒性.而打上泛素标签的PolyQ蛋白可以被细胞内泛素识别结构域所识别，例如含有UBA结构域的泛素接头蛋白hHR23A/B和UBQLN1/2，以及自噬途径中的受体蛋白P62和OPTN等等[33-34].为了揭示泛素修饰在募集这些接头蛋白中的作用，我们实验室研究了PolyQ延伸的Atx3和Htt所形成的包涵体对泛素接头蛋白hHR23B和UBQLN2的募集作用以及分子机制.我们发现，正常细胞内源的hHR23B和UBQLN2蛋白是弥散分布于细胞中的，而当细胞内形成PolyQ蛋白的包涵体时，这两种接头蛋白都能够被募集到包涵体结构中.并且，这两种PolyQ蛋白所形成的包涵体对hHR23B和UBQLN2的募集作用依赖于接头蛋白UBA结构域以及PolyQ蛋白自身的泛素化修饰[35].我们利用hHR23和UBQLN2蛋白的UBA结构域缺失突变以及泛素结合位点突变体研究发现，破坏泛素结合结构域可以影响PolyQ包涵体对这些蛋白质的募集作用.根据相关文献报道，Htt蛋白N端(Htt-N90)的3个赖氨酸可以发生泛素化修饰，而C端Atx3蛋白(Atx3-C)也能够被泛素化[36-37].PolyQ蛋白序列的赖氨酸突变显著抑制了其泛素化修饰，同时也下调了PolyQ包涵体对hHR23B和UBQLN2蛋白的募集作用.这就说明，这两种泛素接头蛋白可以通过结合PolyQ蛋白的泛素化修饰而被募集到包涵体中.

自噬受体蛋白P62和OPTN (optineurin)也常常被检测到存在于包涵体结构中[28, 38]，并且这两种蛋白质与神经退行性疾病的发生发展有密切的联系.P62和OPTN蛋白都含有UBA结构域，可以结合泛素化的底物，从而介导底物蛋白通过自噬途径降解.因此，自噬受体蛋白P62和OPTN也可能通过泛素介导的相互作用被募集到了包涵体中.而包涵体对自噬组分包括受体蛋白的募集作用将可能导致细胞质中可溶性受体蛋白的量减少，从而影响到自噬功能的正常进行[35, 39].除了泛素接头蛋白以外，蛋白酶体的19S小亚基中含有许多能够结合泛素的结构域，如S5α蛋白上具有能够识别泛素和泛素链的UIM结构域，该结构域与泛素的相互作用很可能参与了包涵体对蛋白酶体的募集作用.这也在一定程度上解释了为什么经常在包涵体中检测到蛋白酶体组分.

另外，细胞内存在大量的去泛素化酶，可以识别泛素化的PolyQ蛋白并且介导底物蛋白的去泛素化反应[31]，例如USP14可以促进野生型和突变的Atx3蛋白的稳定，USP26和USP7都可以调节催化AR蛋白的去泛素化.那么，相关的去泛素化酶是否也会由于对PolyQ蛋白的泛素化识别而被募集到包涵体中去呢？有研究发现，在多种包涵体中都能够检测到Atx3蛋白[40-41]，而Atx3既是一种去泛素化酶，又含有PolyQ序列.包涵体对Atx3的募集可能是由PolyQ序列所介导的共积聚效应.但是，作为一种去泛素化酶，Atx3蛋白的N端催化结构域可以识别泛素化底物[37]，而其C端含有串联的UIM结构域，也可以识别结合泛素链[42].因此，Atx3-泛素相互作用也可能参与包涵体对Atx3蛋白的募集作用.最近也有研究表明，Htt包涵体可以募集去泛素化酶USP5和泛素连接酶NEDD4等[43].但是，由于该研究利用的是过表达外源蛋白质的方法进行分析，所观察到的募集效果很可能是由于过表达所导致.因此，PolyQ包涵体对去泛素化酶的募集作用还需要更多的实验证据.

除了泛素化修饰以外，PolyQ蛋白还可以发生其他的翻译后修饰，例如类泛素SUMO修饰[36, 44]以及乙酰化修饰[45]等等.与泛素化一样，PolyQ蛋白也可能通过SUMO化修饰募集细胞内能够识别SUMO的蛋白质到包涵体中.因此，在PolyQ蛋白形成的包涵体中能够检测到SUMO化的蛋白质成分[46].目前鉴定出能够特异性识别SUMO化修饰的序列包括一些蛋白质中的SIM模体、HERC2蛋白的ZZ锌指结构域[47]、以及二肽基肽酶9蛋白上的SUMO1特异结合序列[48].我们推测，含有SIM等结构域特征的SUMO结合蛋白可能会被募集到PolyQ包涵体中.已有研究发现，PolyQ延伸的Atx1和Atx7蛋白可以在细胞核内形成包涵体，并与PML小体相关蛋白共定位[49-50].我们知道，PML小体是通过SUMO与SIM蛋白的相互作用而实现了PML小体对SIM蛋白的招募，从而促进PML小体的形成[51].那么，PolyQ延伸的Atx1和Atx7等是否会通过SUMO化修饰促进包涵体对这些PML小体相关蛋白质的募集，从而使我们能够在包涵体中检测到这些蛋白质呢？这些设想还需要进一步的实验验证.

同样地，其他翻译后修饰(如乙酰基团)也可能作为PolyQ蛋白募集其他蛋白质的分子识别基础.有研究发现，在PolyQ蛋白的包涵体中可以检测到一些去乙酰化酶，例如HDAC3.HDAC3可以与Htt、Atx1、Atx3以及Atx3等PolyQ蛋白相互作用，并且被募集到PolyQ蛋白所形成的包涵体中[52], 而PolyQ蛋白的积聚削弱了HDAC3的去乙酰化酶活性.因此，PolyQ蛋白在积聚过程中，可能募集去乙酰化酶HDAC3到包涵体，从而影响了细胞内乙酰化过程和功能.

有些蛋白质含有与RNA相互作用的结构域，可以参与细胞内RNA相关的调控过程.当这些蛋白质发生积聚时，可以将与之相互结合的RNA募集到积聚物中.我们实验室在对ALS致病蛋白TDP-43的研究过程中发现，TDP-43的C端片段TDP-35能够发生积聚，形成细胞质包涵体[53].该片段除了含有淀粉样积聚核心之外，还含有RRM结构域，能够与细胞内的RNA结合[54].细胞质中的TDP-35包涵体能够将含Poly(A)序列RNA(如mRNA)成分募集到包涵体中[12].另外，细胞内源的TDP-43也会由于含有RRM结构域并与RNA相互作用而被间接地募集到TDP-35所形成的包涵体中.我们将这种通过与RNA相互作用介导的募集作用定义为RNA介导的募集[22](图 2c).

而RNA介导的募集作用也可能是某些PolyQ疾病的致病分子机制.引发SCA2以及ALS等神经退行性疾病的Ataxin-2 (Atx2)蛋白是Lsm蛋白家族中的一员，在细胞内RNA加工以及代谢过程中具有重要的作用[55].Atx2蛋白的N端PolyQ序列下游接续Lsm结构域以及Lsm相关结构域(LSmAD)，该结构域进化上比较保守，可以结合RNA[56].Atx2蛋白可以识别mRNA的3′-UTR区域中富含AU的序列，并且促进底物mRNA的稳定性，促进蛋白质的翻译合成[57].而其C端的PAM2结构域能够和多聚腺苷酸结合蛋白PABP1相互作用，参与Poly(A)RNA的加工调控过程.我们推测，与TDP-35一样，PolyQ延伸的Atx2蛋白在积聚过程中可能将与之结合的mRNA募集到包涵体中，从而使这些底物mRNA不能正常的表达.通过RNA介导的相互作用，突变的Atx2蛋白还可能将细胞内能够识别RNA的野生型的Atx2或其他的RNA结合蛋白募集到包涵体中.据文献报道，Atx2可以和突变的TDP-43以及FUS共定位于包涵体中[58-59]，并且这种联系是通过RNA介导的，突变RNA结合位点则可以破坏这种共定位现象.也就是说，突变的TDP-43或FUS形成的包涵体可以对细胞内源的Atx2蛋白产生募集作用，并且这种募集作用同样也是通过RNA介导的相互作用.

另一种PolyQ蛋白Atx1，也可以结合RNA[60].Atx-1与RNA的结合可能是通过其C端的AXH结构域.因此，PolyQ延伸的Atx1蛋白在积聚过程中也可能通过RNA介导的相互作用募集细胞内其他组分.例如，在PolyQ延伸的Atx1所形成的细胞核内包涵体中可以检测到RNA和mRNA输出因子TAP/NXF1蛋白[61].这些RNA和TAP/NXF1蛋白很可能是通过RNA介导的相互作用而被积聚的Atx1蛋白募集到包涵体中.需要注意的是，野生型的Atx1蛋白在细胞核内也是以点状分布，该结构的形成依赖于RNA[61]，与突变的Atx1在细胞内形成的包涵体在形态和组成上具有一定的相似性.一般认为，正常的Atx1所形成的细胞核内点状结构是动态的，为正常功能的结构；而病理性包涵体是由PolyQ延伸蛋白质所形成的积聚或淀粉样沉淀，不具有功能活性的结构.

当PolyQ蛋白发生错误折叠时，会被细胞内分子伴侣所识别，分子伴侣帮助其折叠成正确构象.但是，PolyQ蛋白积聚并形成包涵体时，也有可能将这些分子伴侣蛋白“挟持”到包涵体中(图 2d).因此，在PolyQ包涵体中常常可以检测到分子伴侣蛋白存在.已有研究报道了多种分子伴侣可以被募集到PolyQ包涵体中，如HSP70、HSP40、HSC70和DnaJB1等[22].分子伴侣蛋白倾向于识别暴露在外的疏水残基和带有正电荷的氨基酸残基，与客户蛋白(client)的结合并无明显的特异相互作用.因此，目前普遍认为分子伴侣通过结合错误折叠的PolyQ蛋白暴露在外的疏水残基而被募集到包涵体中.但是，最近有研究表明，HSC70可以特异地识别Htt蛋白的N端17个氨基酸残基[62].我们实验室的研究发现，分子伴侣HSP90也可以与Htt蛋白的N端序列结合[63].因此我们推测，PolyQ延伸的Htt蛋白是通过这种特异的相互作用募集HSC70和HSP90等分子伴侣的.

综上所述，我们认为在PolyQ疾病中，PolyQ序列的异常延伸改变了蛋白质的溶解性质，增强了蛋白质的积聚特性，使得PolyQ蛋白发生积聚并在细胞内形成包涵体.在积聚过程中，PolyQ蛋白可以通过特异的相互作用募集细胞内其他蛋白质或RNA到包涵体中.PolyQ蛋白所形成的包涵体可以募集功能各异的蛋白质或RNA成分，包括蛋白质降解系统中的组分如蛋白酶体和自噬相关蛋白、分子伴侣蛋白、转录因子以及许多RNA代谢调控蛋白等等[22].而在这些PolyQ疾病中都发现蛋白质降解功能受损，基因转录失调以及RNA代谢活动紊乱等病理特征[64].包涵体的形成和募集作用不仅使得PolyQ蛋白自身的可溶性成分减少，影响其正常功能，同时也会减少被募集的其他成分在细胞内的可溶性组分，损伤其生物功能，最终引起细胞毒性和神经退行性病变.例如，PolyQ延伸的Htt和Atx3蛋白通过自身泛素化募集接头蛋白hHR23B和UBQLN2，从而引起细胞质中可溶性hHR23B蛋白减少，破坏其底物蛋白XPC的稳定性[35].因此，我们认为，PolyQ序列的异常延伸引起蛋白质积聚和包涵体形成，包涵体对细胞中正常蛋白质的募集作用是导致神经退行性疾病的病理原因[22].