ARMS技术的解析（一）

ARMS技术的解析（一）

ARMS-PCR：amplificationrefractory mutation system PCR

AS-PCR：allele specificPCR （或 ASA-PCR）

dF­ARMS-PCR：doublefluorescent-amplification refractory mutation system PCR

突变阻滞扩增系统（amplificationrefractory mutation system, ARMS）又称等位基因特异性扩增法（allele specific amplification, ASA），是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。

ARMS的基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计2条引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测。

ASPCR (allelespecific PCR) 的基本构思是设计2个ASO-F引物，使之与另一引物R构成PCR反应体系。这2个ASO-F引物与探针的ASO不同，等位基因特异性碱基不是位于ASO中间，而是置于ASO-F引物的3′端。这种设计是基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3′→5´外切校正活性的特点，具有保真性能的聚合酶才有3′→5′的外切酶活性，普通的Taq DNA聚合酶只具有5′→3´的聚合酶活性和外切酶活性，缺少3′→5´的外切酶活性，所以他扩增的片段错配率比高保真的要高很多。引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′,5´-磷酸二酯键形成障碍而受阻，故此法又称扩增受阻突变体系（amplificationrefractory mutation system, ARMS）。其扩增结果为：“野生”模板阻碍,“突变”引物放大；或“突变”模板阻碍,“野生”引物放大。

ASPCR点突变的检出率依赖于反应条件的优化和防止引物与靶DNA错配时可能发生的错配延伸，这可以通过调整实验条件，如：引物、靶DNA、Taq酶的浓度和反应温度等来提高特异性，在反应体系中加入甲酰胺亦可减少非特异性扩增。还可通过人为地使引物3′末端的第二个碱基发生错配来阻止错误延伸，TaqDNA聚合酶缺少3′→5´外切酶活性,因此对于3′末端错配的引物,以低于正常末端配对引物的速度延伸,当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时, 3′末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸,反应终止,也就得不到特异长度的扩增条带,从而表明模板DNA没有与引物3′末端相应的突变;如果PCR结果能得到特异长度的扩增条带,表明模板DNA上具有与引物3′末端相应的突变。

近来又有报道：在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，一般为FAM和VIC，首先跑普通PCR，最后通过qPCR扫板即可，通过对产物荧光分析即可了解到模板中是否存在点突变，此法称为双荧光扩增受阻突变系统（doublefluorescent-amplification refractory mutation system, dF­ARMS）。

上篇介绍了ARMS技术的市场应用：厦门艾德和英国DxS。

AmoyDx：ADx-ARMS® 环形引物双扩增技术：

DxS：scorpion ARMS 蝎形探针：该技术所用探针为 Scorpion 探针，Scorpion 探针是一种新型的探针，由一条发夹结构的探针和一条引物构成，探针的 5'端和 3'端分别标有报告荧光和淬灭荧光，3'端通过PCR blocker（一个非扩增的单体,防止探针退火后的延伸）与引物的5'端相连。在自由状态，报告荧光和淬灭荧光很接近，不产生荧光。变性阶段茎环结构打开，退火时引物与模板结合并延伸，环区与新合成的目的基因的互补区域结合，此时 Scorpion 探针与 PCR 产物在同一条 DNA 链上，是分子内的结合。由于发夹结构打开，报告荧光和淬灭荧光分离，因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。由于 Scorpion 探针中序列特异性引物和探针在同一分子上，因此信号的产生特别快。