在流式细胞仪中使用PE和APC的实用指南

        流式细胞术和荧光细胞分选（FACS）使细胞生物学中的分析达到了的水平。利用这些工具，可以针对特定的，具有生物学意义的特征，逐个细胞地筛选和表征整个细胞群。确定给定群体中活细胞的百分比，或量化特定蛋白质或标记物的存在已变得微不足道。实际上，流式细胞术提供了传统酶标仪平台无法实现的一定程度的特异性，并且具有显微镜无法提供的实用性。但也许流式细胞仪的大优点是可以轻松实现多因素分析。

        自成立以来，研究人员一直对流式细胞仪的多因素分析能力感兴趣。由于流式细胞术（即单细胞分析）的性质，可以在任何给定细胞内同时共同监测几个细胞事件。例如，可以筛选细胞的凋亡和表面标志物表达。因为许多生物过程是共同依赖的并且串联发生，所以并行研究多个变量的能力显然是有利的。

        在流式细胞术中，通过同时使用几种荧光探针完成多因素分析或多重分析。这些荧光探针的“颜色”不同，即它们发射荧光的波长。通常选择荧光探针的亮度，表示为染色指数，以及它们与多重面板中其他探针的光谱分离。在潜在的荧光团中，PE和APC已经在流式细胞术中取得了巨大的成功，这是由于它们各自的亮度以及它们在作为串联染料实现时产生光谱分离的能力。

PE＆APC

        藻红蛋白（PE）和别藻蓝蛋白（APC）是称为藻胆蛋白的蛋白质家族的成员。该蛋白质家族存在于光合生物中，例如藻类和蓝细菌。在自然界中，它们通常作为光合作用中叶绿素色素的辅助蛋白质。在结构上，藻胆蛋白由与藻胆素共价结合的蛋白质复合物组成，藻胆素是捕获光能的部分。为了用于流式细胞术，从红藻中提取PE和APC并纯化。

        藻红蛋白（PE）有两种形式：R-PE和B-PE，尽管R-PE在流式细胞仪中有更多用途（因此，速记PE通常可与R-PE互换使用）。PE的分子量为240,000道尔顿，消光系数为1,500,000cm -1 M -1，量子产率（Φ）为0.84。PE在565nm处被大激发（次要大值在495nm处）并且在573nm处发射，其在可见光谱的黄橙色区域中。为了比较，在黄橙色光谱区发荧光的游离Cy3的消光系数为150,000 cm -1 M -1量子产率为0.20（当与DNA结合时，Φ≈0.40）。因此，与Cy3相比，PE更“明亮”。实际上，在大多数实验条件下，PE是可用于流式细胞术的亮荧光团。

        别藻蓝蛋白（APC）是一种105 kDa的蛋白质，消光系数为700,000 cm -1 M -1，量子产率（Φ）为0.68。APC在652nm处大激发（在625nm处具有次级大值）并且在658nm处发射。其荧光落在可见光谱的红色区域。与PE相比，APC并不像“亮”。这部分是由于其消光系数和量子产率较低。这也是因为APC与PE相比发生了红移。因此，用于大程度地激发APC的光源将包含比用于大程度地激发PE的能量更少的能量。然而，与其他红色荧光团如Cy5相比，APC仍然明显更亮，是流式细胞仪的佳选择。

CAT＃

产品名称

规格

Ex（nm）

Em（nm）

2556

PE [R-藻红蛋白]

10毫克

565

575

2554

APC [别藻蓝蛋白]

1毫克

651

662

用于流式细胞术的PE和APC的制备

        为了用于流式细胞术，必须首先将PE或APC与抗体缀合。抗体用作感兴趣靶标的检测器，而PE或APC充当报告物，其将检测到的事件转化为可量化的信号。PE或APC与抗体缀合的传统方法涉及用SMCC活化PE或APC。虽然这里没有详细说明，但一般过程如下：

        虽然已有制备的方法，但SMCC的缀合确实存在若干缺点。首先，结合效率通常较低，良好的产率保持在约30％的回收率。第二个缺点是需要用DTT减少抗体，这可能显着影响它们的功能。后，因为基于SMCC的反应的效率通常较低，所以需要非常高浓度的反应物（即PE和抗体）以获得足够的反应性。

        SMCC化学有几种替代方案。这些替代方案通常依赖于首先独立地缀合报道分子和检测器，每个分子具有不同的标签。通常选择这些标签是因为它们彼此之间的高亲和力和特异性，并且仅相互之间，因此当标记的报道分子和检测器混合时，标签结合，在报道分子和检测器之间形成生物缀合物。

        这种类型标记的一个相当确定的用途是生物素 - 链霉抗生物素蛋白缀合系统。在该系统中，用生物素标记或标记抗体。然后用链霉抗生物素蛋白标记检测器，例如PE。由于生物素和链霉抗生物素蛋白彼此之间具有高亲和力，它们形成强共价键，在这种情况下终导致抗体-PE生物共轭物。

        SMCC化学的第二种替代方案是AAT Bioquest的Buccutite™技术。与生物素 - 链霉抗生物素蛋白缀合系统类似，Buccutite™技术依赖于两个独立的标签：MTA和FOL。这两个标签分别独立记在报道分子和检测器上，并且当混合时将彼此强烈结合，产生报告子 - 检测器生物缀合物。与其他共轭化学相比，Buccutite™具有多项独特优势。首先，Buccutite™反应通常具有高得多的产率，终回收率超过SMCC方法的两倍（> 60％）。此外，因为MTA和FOL之间的反应非常有效，所以反应可以在非常低的反应物浓度下发生（即