如题:
探测内参actin的时候,各个条带并不很浓,但都连在一起,看不出泳道来。
会是什么原因。
另:有时转膜会出现星星样的小点,布满整个凝胶。
大分子量蛋白往往有转移不好的情况,虽然并不影响自己探测的蛋白。
以下附上WB的详细步骤:
1、 细胞总蛋白的提取
A、 用培养皿(10cm)或培养瓶(75cm2)将细胞(Hela或HepG2)培养至约80-90%的平铺率;
B、 倒去培养基,并用PBS冲洗2-3次;
C、 加入0.5-1ml胰酶,37℃消化3-10min;
D、 加入3mL无血清培养基终止消化反应,并用枪头反复吹打至细胞从培养壁上脱落;
E、 收集细胞悬液至15mL离心管中,1500rpm离心10min收集细胞体(约100uL体积大小);
F、 用500uL PBS重悬细胞并转移至1.5mL离心管中,3000-5000rpm离心5min收集细胞;
G、 弃去上清并用枪头吸干液体,加入50-200uL裂解液(RIPA已加入蛋白酶抑制剂),吹打均匀后,冰上放置20min,液氮反复冻融2-3次;
H、 14000×g离心15min,将上清收集到新的离心管中;
I、 以BSA为基准测定蛋白吸光度及浓度(约5-35mg/mL)。
2、 SDS-PAGE
A、 配置12%的分离胶(20mL)和3%的浓缩胶(10mL);
B、 用2×Loading buffer(15uL)与蛋白提取液(15uL)等体积混匀后,沸水浴中煮5-10min;
C、 每孔上样20uL样品,5uL预染蛋白Marker,没有样品的孔加入5uL 2×Loading buffer;
D、 调节电压100V(或先80V再120V)电泳90-120min;
E、 转膜的胶水中暂存,另一块可以直接染色(考马斯亮蓝染液中煮沸5-10min,脱色)。
3、 转膜
A、 用转膜缓冲液浸湿转膜器件(夹子、滤纸、垫片)并依次排好;
B、 将剪好的PVDF膜(0.45um)(比胶略大但比滤纸小)先在甲醇中浸湿(不超过15s),后覆盖在正极滤纸上;
C、 随后将胶覆盖在PVDF膜上;
D、 再放上一层滤纸后,用玻璃棒或15mL离心管赶出气泡;
E、 夹好夹子,放入转移槽,加满转移缓冲液;
F、 20V转移过夜,一块膜时电流大约为13-15mA,用的是六一的转移槽;
G、 转好的膜放入TBST缓冲液中。
4、 免疫印迹
A、 用TBST配置的5%脱脂奶封闭膜(4℃过夜或37℃ 1hr);
B、 用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液,加入一抗(1:300(β-actin)),37℃孵育1hr(或4℃过夜);
C、 TBST洗涤膜5min,2次,然后用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液,加入二抗(1:5000,牛抗兔二抗),37℃孵育1hr;
D、 TBST洗涤膜5min,2次,用于显色反应。
5、 发光反应
A、 加入一定量ECL(整块膜大约需要2.5-3mL的ECL混合液),将膜全部覆盖;
B、 5min后,移入暗室准备压片(光片剪角),视荧光强度选择压片时间;
C、 压片10s-2min,后分别显影(可在灯下观察显影强度,控制显影时间),定影(2min即可);
D、 膜保存在TBST中,可反复利用。
总蛋白SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色:可见泳道间扩散相连
actin的WB结果 连成一条线而看不出泳道
转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染色 有时会出现星星样的点点
但大部分还是这种情况:90kD一下蛋白转移较好,而大分子量蛋白往往转移不好(20V overnight)
[ Last edited by zplipeng on 2011-12-8 at 14:34 ] 返回小木虫查看更多
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