用OD值评判DNA和RNA质量

1、根据OD值计算核酸浓度

因为核酸分子里含有嘌呤和嘧啶，它们具有共轭双键，在波长260 nm处有最大吸收峰，所以核酸的最大吸收波长是260 nm。蛋白质的最大吸收波长是280 nm。

在波长260 nm处测定的OD值记为OD260。如果样本是纯净的，OD260值可以用于计算核酸样品的浓度。1 OD260相当于50 μg/mL双链DNA，或者30 μg/mL（40 μg/mL）单链DNA（RNA），或者20 μg/mL寡核苷酸。

2、根据OD值评估核酸纯度

在波长260 nm和280 nm 处测定的OD值的比值记为OD260/280。它可以用于评估核酸样品的纯度。纯DNA的OD260/280比值为1.8；纯RNA的OD260/280比值为2.0。

通常情况下，提取之后经过适当纯化、纯度较高的DNA样品，OD260/280在1.6-1.8之间，能够满足大多数分子生物学实验的要求；经过纯化、纯度较高的RNA样品，OD260/280在1.9-2.0之间，也能够满足大多数分子生物学实验的要求。

如果DNA样品的OD260/280比值高于1.8，表明该DNA样品中有RNA残留；低于1.6，表明有蛋白质和/或苯酚残留（也称为污染）。如果RNA样品的OD260/280比值高于2.0，表明有异硫氰酸胍残留；低于1.9，表明有蛋白质和/或苯酚残留。

另外，OD230用于评估样品中是否存在碳水化合物、多肽、苯酚等污染物。较纯净的核酸样品，OD260 /230 比值大于2.0。

3、影响OD值的因素

当一束光通过一种吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度(absorbance，A)就是用来衡量光被吸收程度的物理量。吸光度是指光线通过溶液(或某一物质)前的入射光强度与通过溶液（或某一物质）后的透射光强度的比值的对数。吸光度也称为光密度(optical density，OD)，二者是同义词。

OD＝log(1/trans)

其中，trans为检测物的透光值。

根据实验测定，

A＝abc

其中：

a为吸光系数，单位L/(g·cm)。

b为液层厚度，通常为比色皿的厚度，单位cm。

c为溶液浓度，单位g/L。

影响吸光度的因素是b和c。吸光系数(a)与入射光的波长以及被光通过的物质有关，当入射光的波长固定，介质为同一种物质的时候，吸光系数就不变。所以a是一个与溶质有关的常量。由于温度通过影响c而影响A，所以影响A的因素有溶剂、浓度、温度等。

一般来说，OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度，OD230代表其他杂质(多糖等)的吸光度。A260/280与OD260/280意思是一样的。

研究发现，核酸抽提过程中使用的许多试剂会影响OD260 和OD280 读数。对同一样品进行10倍梯度稀释后分别测定OD值，可以发现，分光光度计的吸光值仅能在一定范围内保持线性。

当A260读数在0.1-0.5之间，且A200到A320之间的数值构成一条光滑曲线时，

·       少量苯酚残留(30 μL/mL)，使A230、A260和A280均变大，差不多增加一倍，但A260/A280和A260/A230均在2.0左右。

·       少量异硫氰酸胍残留(132 μM)，使A230变大，但A260、A280几乎不变。所以A260/A280仍在2.0左右，而A260/A230远低于2.0。

·       大量异硫氰酸胍残留(2.4 M)，使A230、A260和A280均变大，没有办法测定。

·       PEG残留(6.25%)，使A230、A260和A280均变大，对A230和A260影响更大，所以A260/A280远大于2.0，而A260/A230仍在2.0左右。

4、实验操作注意事项

常用的核酸抽提试剂，如Phenol、Guanidine Isothiocyanate、PEG，都能使A260和A280值变大，但是却能维持二者的比值不变，与纯核酸的一致。

1、避免蛋白质残留：适当减少起始样品量，确保样本细胞被充分裂解。加入氯仿后要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。确保不要吸入中间层及有机相。如果所得RNA的OD260/280比值偏低，可以用酚/氯仿重新抽提一次，然后再次沉淀、溶解。

2、避免苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

3、避免多糖或多酚残留：在一些特殊种类的组织样本和植物样本中，多糖、多酚含量较高，其残留会导致OD260/280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要采取额外步骤去除多糖、多酚。

4、保持测定值在仪器设备的线性范围内：测定OD260及OD280值时，要注意使OD260的读数在0.1-0.5之间，此范围内线性最好。

5、不要用水稀释核酸样品：无论对照样品还是待测样品，都要用10 mM Tris-Cl，pH7.5稀释，不要用水稀释样本。用水稀释核酸样品导致OD值偏低。

（根据网络资料整理，数据可能不准确。供参考）