2020

20200706·Kony

文献信息 影响因子： 7.068 期刊年卷：J. Exp. Clin. Cancer Res. 2020 Jan 30;39(1) DOI：10.1186/s13046-020-1528-x 作者列表: Feng J, Dai W, Mao Y, Wu L, Li J, Chen K, Yu Q, Kong R, Li S, Zhang J, Ji J, Wu J

背景：HCC高发病，且诊断时多为晚期；索拉菲尼是晚期HCC有效的靶向分子药物，但索拉菲尼耐药性限制了其疗效；Simvastatin是降低胆固醇的他汀类药物，可抑制肿瘤生长 研究目的：索拉菲尼与simvastatin 联合用药是否可以改善HCC对索拉菲尼的耐药性 实验方法： 建立索拉菲尼耐药细胞系（LM3-SR），通过WB、流式和药物实验检测细胞增殖、凋亡和糖酵解水平，探究索拉菲尼耐药与糖酵解之间的联系；异种移植模型体内验证simvastatin 的作用；通过活化剂和抑制剂以及慢病毒转染探究分子机制 实验结果： simvastatin通过抑制PKM2介导的糖酵解抑制HIF-1/α/PPAR-γ/PKM2信号轴，从而抑制HCC的增殖，促进HCC凋亡。对索拉菲尼细胞再次敏感

据2018年全球癌症统计，肝癌发病率全球排名第四，诱患病因素有乙型肝炎病毒感染、酒精滥用，或黄曲霉毒素B1吸入导致等，治疗的手段主要是外科手术切除，经动脉栓塞术，放疗和化疗，但通常诊断不及时以及癌细胞的转移扩散导致HCC发展至晚期，无法通过以上手段进行有效治疗。

索拉菲尼是一种多激酶抑制剂，用于晚期HCC的一线治疗。在两项III实验中表明，索拉菲尼可有效延长HCC患者2-3个月的总生存期。然而，由于用药6个月后产生的获得性耐药使得只有约30%的患者真正获益。索拉菲尼耐药的机制复杂且不确定，包括HCC细胞EGFR的表达升高、c-Jun和Akt活化，上皮-间充质转化，肿瘤干细胞的比例升高，以及缺氧环境的形成等。最近有研究发现，索拉菲尼可以破坏HCC细胞的氧化磷酸化，促进无氧糖酵解的进行。尽管无氧糖酵解是癌细胞的显著标志，但很少有研究关注无氧糖酵解与索拉菲尼耐药之间的联系。目前，临床上针对索拉菲尼耐药的治疗策略包括与其他药物的联合服用，其中有靶向特定分子的药物，如抗-EGFR抗体（Cetuximab）,细胞毒化疗药物（Epirubicin, Cisplatin,5-FU和Capectiabine），免疫治疗药物（抗-PD-1抗体）。然而，联合疗法通常受限于严重的副作用，比如腹泻和器官损伤。因此，十分需一个安全的药物来逆转HCC细胞对索拉菲尼的耐药性。simvastatin 是一种降低胆固醇的他汀类药物，竞争性抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）的活性，阻碍胆固醇的生物合成。

最近有许多研究揭示了他汀类药物同样具有其他的作用，包括抗氧化、抗增殖、抗炎症，以及发挥保护内皮血管等作用。他汀类药物在预防肝病如非酒精性肝病、肝纤维化和肝硬化等。此外，他汀类与其他药物联用通常具有协同作用。然而，很少有研究simvastatin与索拉菲尼联用治疗索拉菲尼耐药的HCC，以及其对无氧糖酵解的影响

因此，在此项研究中，作者联合simvastatin与索拉菲尼处理索拉菲尼耐药的HCC细胞，探究潜在的机制。

细胞系：四种HCC细胞系：HCC-LM1，SMMC7721,Bel-7402和Huh7与一种肝母细胞瘤细胞系HepG2 - 索拉菲尼的半致死率浓度（IC50）检测：索拉菲尼给药24h，CCK-8检测下拨活性 Fig. 1a：4.47 μM (LM3), 8.79 μM (SMMC-7721), 8.98 μM (Bel-7402), 4.65 μM (HepG2), and 7.26 μM (Huh-7) LM3的索拉菲尼IC50 最低，意味这LM3对索拉菲尼的敏感度最高，因此选取了LM3作为索拉菲尼敏感细胞，随后建立索拉菲尼耐药的LM3细胞系用于探究索拉菲尼耐药的机制 LM3-SR的索拉菲尼IC50为16.33uM，大约是LM3细胞的四倍，即索拉菲尼耐药的LM3细胞成功建立。

- 以索拉菲尼浓度为15uM处理索拉菲尼敏感LM3细胞和索拉菲尼耐药LM3 ，通过细胞增殖实验和流式探究耐药细胞的特征 Fig. 1b：15uM索拉菲尼处理后，LM3细胞克隆形成收到抑制，而LM3-SR收到的抑制作用较低，揭示LM3-SR细胞增殖能力较LM3更强； Fig. 1c：Hoechst 33342染色揭示LM3种凋亡（阳性）细胞显著多于LM3-SR Fig. 1d：流式结果表示，LM3-SR细胞暴露于索拉菲尼后凋亡的比例远低于LM3细胞。

结论：这些发现提示，LM3-SR细胞对索拉菲尼抗性更强，收到索拉菲尼的抑制增殖和促凋亡的影响较小

无氧糖酵解是肿瘤细胞代谢的重要标志，无氧糖酵解增强的特征包括葡萄糖大量消耗和乳酸大量产生。有研究表明，长期服用索拉菲尼可以导致无氧糖酵解增强，这可能与索拉菲尼耐药相关。 - 检测LM3-SR细胞糖代谢水平 Fig. 2a：LM3-SR细胞的葡萄糖吸收的乳酸产生的量均高于LM3-SR细胞，提示LM3-SR细胞糖酵解水平高于LM3-SR细胞； 此外，15uM的索拉菲尼可有效抑制LM3细胞的葡萄糖吸收和乳酸生成，而在LM3-SR细胞中的抑制作用较小。

- WB检测参与糖酵解过程的三个关键酶，包括己糖激酶2（HK2）,磷酸果糖激酶（PFK1）和丙酮酸激酶II（PKM2），和OXPHOS Fig. 2b：LM3-SR细胞中糖酵解相关蛋白和OXPHOS受损相关蛋白的表达水平较高； - 同时检测了增殖指示分子PCNA，以及凋亡标志物Bcl-2，Bax，caspase 3 和剪切的PARP Fig. 2b：索拉菲尼对LM3-SR细胞的增殖、糖酵解和自噬诱导的抑制作用受到限制，即提示索拉菲尼耐药于糖酵解增强相关

- 相比较LM3细胞，Bel-7402细胞可能具有先天的索拉菲尼耐药性，故选择Bel-7402细胞探索索拉菲尼耐药的机制（Fig. S1）

- 进一步探索体内HCC细胞索拉菲尼耐药的机制，将LM3和LM3-SR细胞种入裸鼠中建立异种移植肿瘤模型 Fig. 2c：LM3-SR细胞诱导的肿瘤体积是LM3细胞的三倍多，索拉菲尼（10mg/kg）对LM3-SR组肿瘤的抑制作用无法达到对LM3组的抑制效果；

Ki-67是表示肿瘤细胞的分化程度的指标，表示肿瘤增殖数值。Ki-67是目前应用较多的增殖细胞标记物, 除了G0期不表达, Ki-67在细胞繁殖的每个阶段都有表达, 细胞有丝分裂后Ki-67丢失抗原决定簇, 迅速降解, 其半衰期较短, 检测结果可靠, 可较好地反映细胞的增殖活性。 [图片上传中...(image.png-240823-1594100116398-0)]

Fig. 2d：H&E，TUNEL和Ki-67的IHE染色结果显示，LM3-SR组细胞坏死（粉色区域）和细胞凋亡（核深染）的比例减少，但LM3-SR细胞含有更多的肿瘤实质细胞，Ki-67着色也更多，索拉菲尼（10mg/kg）的治疗效果减弱

结论：索拉菲尼耐药的LM3-SR细胞与糖酵解水平升高相关，这可能导致索拉菲尼体内治疗效果减弱

simvastatin通常用于减低血脂，最近有研究发现simvastatin具有抗癌和抗纤维化的作用。 - 通过CCK-8探索simvastatin对LM3，LM3-SR和正常肝细胞LO2的影响 Fig. 3a：IC50值--LM3-55.99uM，LM3-SR-14.93uM，LO2：74.92uM；LM3-SR对simvastatin 的敏感性程度是LM3和LO2的3.75倍；10uM的simvastatin 可以致死LM3-SR细胞，而对LO2细胞的活性没有影响； - 选择了10uM和0uM两个浓度的simvastatin探究其对LM3和LM3-SR细胞凋亡和糖酵解的作用 Fig. 3b-c：10uM的simvastatin 对LM3细胞凋亡的诱导作用不显著，但LM3-SR细胞中细胞凋亡水平较高；50uM的simvastatin对LM3和LM3-SR细胞均具有诱导凋亡的作用 Fig. 3d：10 uM的simvastatin无法降低LM3细胞乳酸的产量或葡萄糖吸收的多少，而50uM的simvastatin 可有效发挥抑制作用；而无论是10uM还是50uM,simvastatin都可降低LM3-SR的乳酸产量和葡萄糖的吸收； Fig. 3e：WB进一步验证PCNA，Bcl-2，Bax，Caspase 3，剪切的PARP，糖酵解相关你的酶和OXPOHS的蛋白表达水平

- LM3-SR细胞对simvastatin的敏感性很高，故15uM的索拉菲尼与10uM的simvastatin联合使用，检测simvastatin 是否能增强LM3-SR细胞对索拉菲尼的敏感性

- 通过qPCR检测糖酵解、葡萄糖和脂肪酸代谢相关的基因 Fig. 5a：在18中候选基因中发现，索拉菲尼和simvastatin共培养降低了PKM2，HIF-1α以及PPAR-γ（过氧化物酶体激活γ受体）的转录最为明显；WB检测同样验证了qPCR的结果；simvastatin激活了PPAR-α的转录，并检测了PPAR-α蛋白水平的表达； Fig. 5b：与索拉菲尼单独处理一样，索拉菲尼联合simvastatin共处理不能抑制PPAR-α的表达； Fig. 5c：免疫荧光染色展示，索拉菲尼联合simvastatin共处理后，PKM2、HIF-1α和PPAR-γ的免疫荧光强度降低； Fig. 5b-c：从PKM2的定位看出，索拉菲尼联合simvastatin共处理不仅抑制PKM2的表达总量，同时特异性抑制PKM2在细胞核中的表达； Fig. 5d：通过质-核蛋白抽提试剂盒区分蛋白质的细胞器定位，WB进行验证；此外，HIF-1α和PPAR-γ大多定位在细胞核，simvastatin处理可抑制二者在细胞核的表达 - 基于PKM2、HIF-1α和PPAR-γ可定位于细胞核，作者设计了Co-IP实验以明确他们之间的相互作用 Fig. 5e：HIF-1α和PPAR-γ可以被PKM2拉低，提示二者均可以在细胞核中与PKM2相互作用

- 通过HIF-1α/PPAR-γ/PKM2信号通路的激动剂和抑制剂，探究simvastatin对HIF-1α，PPAR-γ以及PKM2的影响 Fig. 6a：50uM的FG-4592可有效上调HIF-α，PPAR-γ以及PKM2；在索拉菲尼与simvastatin 联合用药组，FG-4592诱导的上调发生逆转；10mM的BAY87-2243可显著降低HIF-1α，PPAR-γ以及PKM2的表达；而在索拉菲尼和simvastatin共处理后，他们的抑制效果得到叠加 - 同样检测了HIF-1α，PPAR-γ和PKM2在核的表达 Fig. 6b：索拉菲尼与simvastatin共处理后，FG-4592与BAY87-2243的激活与抑制作用分别与上述相似，反映出索拉菲尼与simvastatin共处理可抑制HIF-1α, PPAR-γ 和 PKM2 在细胞核的表达

- 这些结果提示HIP-1α是PPAR-γ和PKM2的上游调控因子，接下来用PPAR-γ的激动剂和抑制剂再次验证该假设 Fig. 6c：10uM的PPAR-γ的激动剂Rosiglitazone处理后，PPAR-γ与PKM2的表达上调，而HIF-1α的表达量与对照组相似；而索拉菲尼与simvastatin共处理后，Rosiglitazone无法再上调PPAR-γ和PKM2的表达，而HIF-1α仍保持与对照组相近的表达水平；此外，PPRA-γ的抑制GW9662(2uM)可有效抑制PPAR-γ和PKM2的表达，而HIF-1α的表达水平保持不变；索拉菲尼与simvastatin共处理后，PPAR-γ和PKM2表达下调更为明显； Fig. 6d：在核中，HIF-1α，PPAR-γ和PKM2的变化与总蛋白水平的变化相同 实验结果提示，HIF-1是PPAR-γ的上游调控因子，而PKM2是PPAR-γ下游的调控因子，基于此，选择PKM2的激动剂和抑制剂再次验证

PKM2是激酶，DASSA58可以提高PKM2的酶活性，但是抑制其表达，而复合物3K可以减弱PKM2的酶活性，但促进其表达

Fig. 6e：复合物K3（3uM）处理后，PKM2的表达上调，而PPAR-γ与HIF-1α的表达与对照组无差异；而 复合物K3与索拉菲尼和simvastatin共处理后，PKM2的上调减弱，HIF-1α与PPAR-γ的表达与索拉菲尼和simvastatin联合处理组无差异；DASA58(40uM)与复合物K3的作用效果完全相反； Fig. 6f：细胞核中，复合物K3或DASA58处理后与总蛋白的表达变化相似 结论：HIF-1α是PPAR-γ的上游调控因子，PKM2是PPAR-γ的下游调控因子，HIF-1α/PPAR/PKM2轴被simvastatin被抑制 PKM2不仅是糖酵解过程中的一个限速酶，也是核的重要转录因子 - 通过慢病毒包装探索PKM2在索莱菲妮耐药过程中的作用机制 Fig. 6g：在LM3细胞中过表达PKM2（LM3-PKM2-OE） Fig. 6h：在LM3-SR细胞中敲低PKM2（ LM3-SR-PKM2-KD ）

Fig. 6i-j ：LM3过表达PKM2时，PCNA表达上升；而Bax，caspase-3以及OXPHOS表达收到抑制；此外，乳酸产量核葡萄糖吸收水平增加；而在LM3-SR细胞中敲低PKM2时，洗宝宝增殖，凋亡抑制核糖酵解水平全部收到抑制，提示LM3-SR细胞对索拉菲尼的耐药性获得逆转； - CCK-8验证LM3细胞中过表达PKM2会导致对索拉菲尼产生抗性这一假设 Fig. 6k：LM3-PKM2-OE细胞索拉菲尼半致死浓度为8。68uM(LM3:4.47uM)； Fig. 6l：LM3-SR中细胞敲低PKM2时，索拉菲尼与simvastatin共处理组中，相比较索拉菲尼单独处理，simvastatin无法抑制PKM2，PCNA，Bcl-2的表达，也无法上调Bax，caspase-3he OXPHOS的表达；

- 结论：HIF-1α/PPAR-γ/PKM2轴是simvastatin发挥药效的靶点之一，也证实了过表达PKM2或导致LM3细胞对索拉菲尼产生耐药性，而敲低PKM2或能提到LM3-SR细胞对索拉菲尼的敏感性

对人类来说，对索拉菲尼产生抗性的平均时间大约是12.2个月，但可能在几个月到几年之间变化，建立索拉菲尼耐药的HCC细胞系通常需要12个周。

索拉菲尼耐药机制的研究现状：

有研究表明，simvastatin参与抑制糖酵解与索拉菲尼耐药； Christile等人发现，他汀类可部分阻断糖酵解产生的ATP的利用； Huang等人发现，pitavastatin 和 paclitaxel的联合用药可以显著降低肾细胞癌糖酵解速率； Nowis等人，报道，他汀类破坏从人类肝分离的细胞的葡萄糖吸收； 这些研究提示simvastatin或也可以有效抑制糖酵解，改善糖酵解介导的索拉菲尼耐药；

无氧糖酵解过程中有三个关键限速酶，分别为HK2,PFK1和PKM2，其中，PKM2催化糖酵解的最后一步，在多种肿瘤中均表达升高； PKM2在肿瘤细胞中主要发挥的三个作用： （1）胞质PKM2是一种具有高酶活性的四聚体，参与糖酵解，为癌细胞生物合成提供更多的代谢中间体；（2）PKM2的二聚体亚型可移位至细胞核，作为转录共激活因子，从而促进有利于生长的基因的转录，如GLUTs、HIF-1、VEGF-A、Bax、Bcl-2和PCNA；（3）PKM2还可以在氧化应激下易位至线粒体，与Bcl-2 / Bcl-xl相互作用，从而抑制癌细胞凋亡； 基于PKM2的以上作用，Zhang等人报道沉默PKM2可以使Hep3BSR和LM3-SR细胞对索拉菲尼再次致敏； Wong 等人发现PRMT6-ERK-PKM2调控轴参与HCC细胞索拉菲尼耐药和葡糖糖代谢；

PKM2基因的表达由多种因子驱动，包括HIF-1α，STAT3，β-Catenin和NF-κB

HIF-1α是参与细胞应答缺氧的调控因子，可直接激活糖酵解相关基因（GLUTs和PKM2）的转录促进癌细胞糖酵解; PPAR-γ通过调节糖脂代谢在维持能量稳态方面发挥重要作用，PPAR-γ在癌细胞中表达升高，导致肿瘤生长加速； 但PPAR-γ受体激动剂和拮抗剂在肿瘤治疗过程中的作用十分复杂，因为它们都被发现可以抑制肿瘤细胞的生长； PPAR-γ可以促进脂代谢过程中葡萄糖的吸收，诱导糖酵解蛋白（如GLUT-4）的表达； 有研究发现，atorvastatin可以抑制HIF-1α/PPAR-γ途径和诱导多能干细胞的存活； 此外，Panasyuk等人报道，PPAR-γ可促进脂肪肝中PKM2和

索拉菲尼耐药的机制复杂，除了当前对HIF-1α/PPAR-γ/PKM2轴的探究，PKM2的异构体PKM1同样被报道通过自噬增强糖酵解，导致癌细胞产生耐药性； 此外，原癌基因c-Myc，N-Myc和L-Myc在HCC糖酵解中同样发挥重要的作用；

据报道，C-Myc在HCC细胞中过表达，可通过增加糖酵解相关标志物的表达（如GLUT1，LDH和PKM2）促进Warburg效应； 相反，细胞核中的PKM2也可以调控c-Myc，因为PKM2可以移位到细胞核中，作为β-catenin的辅激活剂，诱导c-Myc表达，导致c-Myc靶向基因的表达; 此外，c-Myc高活性将增强癌细胞中谷氨酰胺分解，促进癌症进展； 基于以上，作者预测c-Myc可能成为治疗HCC下拨索拉菲尼耐药的潜在靶点。