47例MLL重排急性白血病患者EVI1和BRE基因表达及其临床意义

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分析伴有11q23/MLL重排急性白血病（AL）患者中EVI1及BRE基因高表达的发生率、相关性及其临床意义。

采用骨髓细胞短期培养法制备染色体，R显带技术进行核型分析；采用MLL双色断裂点分离探针和FISH技术对47例患者进行MLL重排检测；实时定量RT-PCR（RQ-PCR）法检测患者EVI1和BRE基因的表达，并对其相关性和临床意义进行分析。

47例患者核型均涉及11q23易位，FISH检测MLL重排均为阳性。其中37例患者行免疫表型检测，5例表达B淋系抗原CD19、CD79a或CD10，1例表达T淋系抗原CD7，余表达髓系或髓单核系抗原CD33、CD13、CD14和CD15，其中16例同时CD34（+）。RQ-PCR检测显示18例患者EVI1基因高表达，其中以t（6;11）核型和M4/M5亚型最多见；t（6;11）组和t（9;11）组EVI1表达水平均高于正常对照组（P值分别为0.038和0.022）。15例患者BRE基因高表达，其中以t（9;11）核型和M4/M5亚型最多见。t（4;11）、t（6;11）、t（9;11）、t（11;19）组EVI1表达水平与正常对照组相比均增高（P值均表1基因扩增引物序列引物序列（5′→3′）PBGDF：GATACGAAGGGATGTACCAR：CTCGGCCAGGGTGTTGAAP：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCTTAMRAEVI1F：ACCCACTCCTTTCTTTATGGACCR：TGATCAGGCAGTTGGAATTGTGP：FAM-TGAGGCCTTCTCCAGGATTCTTGTTTCACTAMRABREaBRE基因引物和探针使用成品荧光探针引物预混液Open in a separate window

注：F：正向引物；R：反向引物；P：探针；a引物序列参照文献[6]购买

6．治疗：所有患者均接受正规化疗，其中12例患者于化疗后缓解状态行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗。

7．随访：47例患者治疗后3个月左右随访1次，包括电话及来院复查随访，末次随访时间为2015年2月15日。

8．统计学处理：应用SPSS 17.0软件进行统计分析。Kaplan-Meier方法进行总体生存分析及生存曲线的绘制，Pearson检验用于检验两种基因表达间的关联性，Cox比例风险模型用于多因素预后分析。P表2MLL重排类型在急性白血病FAB亚型中的分布情况[例（%）]组别例数t（4;11）/AF4t（6;11）/AF6t（9;11）/AF9t（11;19）/ELL其他类型ALL87（87.5）1（12.5）000M4/M5281（3.5）11（39.3）8（28.6）4（14.3）4（14.3）AML（除M4/M5）111（9.1）5（45.4）3（27.3）1（9.1）1（9.1）合计479（19.1）17（36.2）11（23.4）5（10.6）5（10.6）Open in a separate window

注：ALL：急性淋巴细胞白血病；AML：急性髓系白血病

2．免疫表型分析：37例进行免疫表型检测的患者中，5例表达B淋系抗原CD19、CD79a或CD10，1例表达T淋系抗原CD7，余表达髓系或髓单核系抗原CD33、CD13、CD14和CD15，其中16例同时表达CD34。

3．双色间期FISH检测MLL重排：15名正常对照者的MLL基因重排阳性细胞率为（0.54±0.51）%，取大于x+3s为阳性界值，即>2.07%定义为阳性。结果显示，47例患者均为MLL重排阳性。图1为1例患者的FISH结果。

一红一绿一黄色荧光信号为MLL基因重排阳性细胞（箭头所示）

4．EVI1基因的表达水平分析：15名正常对照者EVI1基因中位表达水平为0.94（0.13~1.27），将EVI1基因表达水平>8定义为高表达[4]。EVI1基因表达在各组间的具体情况见表3。EVI1基因高表达患者为18例（38.3%），在不同MLL对手基因组中，EVI1基因高表达发生率从高到低依次为t（6;11）组（10/17，58.8%）、t（9;11）组（5/11，45.4%）、t（11;19）组（1/5，20.0%）、其他组（1/6，16.7%）、t（4;11）组（1/9，11.1%）。其中以t（6;11）核型和M4/M5亚型最多见。ALL、AML-M4/M5、非单核系AML组EVI1基因表达水平分别与正常对照组比较，差异无统计学意义（P值均>0.05）。如将AML-M4/M5和非单核系AML归为髓系AML组，则髓系组与正常对照组的EVI1基因表达水平比较差异有统计学意义（P=0.012）；EVI1基因表达水平在MLL不同对手基因组间的差异明显，t（6;11）组、t（9;11）组EVI1表达水平均显著高于正常对照组，且差异有统计学意义（P值分别为0.038和0.022）；t（4;11）组、t（11;19）组及其他类型组与正常对照组相比差异无统计学意义。另外，按照以上两种方法分类后，各组间EVI1基因表达量比较差异均无统计学意义。

7．生存期分析：47例患者中35例患者因各种原因死亡，12例存活。总体中位生存期为10.0（0.8~31.0）个月。根据EVI1表达情况将患者分为高表达组18例，低表达组29例，两组中位生存期分别为7.0和13.0个月，差异有统计学意义（P=0.049）（图2）。t（6;11）组中EVI1高表达者（10例）和低表达者（7例）中位生存期分别为8.75和13.0个月，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）；t（9;11）组中EVI1基因高表达（5例）和低表达组（6例）中位生存期分别为4.5和11.0个月。其他组因例数少，未进行统计学分析。根据BRE表达情况，将患者分为高表达组15例，低表达组32例，两组中位生存期分别为13.0和10.75个月，差异无统计意义（P>0.05）。t（9;11）组中BRE高表达（6例）和低表达组（5例）中位生存期分别为11.0和4.5个月。而17例伴t（6;11）核型患者中仅1例为BRE基因高表达。根据EVI1和BRE两者的表达情况，将患者分成BRE高表达而EVI1低表达组（15例），BRE低表达而EVI1高表达组（18例）和BRE及EVI1均低表达组（14例），三组中位生存期分别为13.0、8.25和12.25个月，三组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。将t（6;11）异常患者同上分成三组，第一组仅1例，生存期为16.0个月，第二组10例，中位生存期为8.75个月，第三组6例，中位生存期为12.25个月。因病例数较少，三者之间无法进行统计学分析。将t（9;11）患者同样分组，BRE高表达而EVI1低表达组6例，BRE低表达而EVI1高表达组5例，未见BRE及EVI1均低表达患者。前者中位生存期11.0个月，后者为4.5个月。

MLL基因重排急性白血病患者常规治疗效果差，预后不佳，因此MLL基因重排是影响该类患者长期生存的独立的因素之一。AML中最常见的异常为t（9;11）、t（6;11）、t（11;19）、t（10;11），ALL中最常见的为t（4;11）。越来越多的研究发现，伴有不同甚至相同MLL融合基因的急性白血病，其临床特征也有一定的异质性，表明该类白血病在具有一定的共同特征基础上，又具有一定的生物学背景差异。

EVI1基因位于人类染色体3q26.2，研究发现8%~10%成人AML有EVI1基因高表达，其中20%为11q23/MLL重排急性白血病。EVI1基因高表达预后不良，被认为是独立的预后不良指标[7]。Bindels等[4]报道，43%的11q23/MLL重排AML有EVI1基因高表达，且EVI1高表达与MLL对手基因无特异相关性。他们将MLL重排急性白血病分成EVI1高表达组和低表达组，前者预后不良，可发生于多种FAB亚型，后者较为良好，常为M4/M5亚型。Gröschel等[8]研究显示EVI1高表达发生于45.8%的11q23/MLL重排AML，其中t（6;11）AML中发生率为83.9%，t（9;11）AML中为40%，其他易位AML中为34.8%，并认为EVI1低表达且核型为t（9;11）者M5多见，初诊时白细胞计数较低，EVI1高表达组5年生存期明显低于低表达组。

本组47例急性白血病患者均伴有11q23易位，经FISH证实均为MLL重排阳性。其中39例为AML，8例为ALL。18例为EVI1基因高表达，其中17例为AML，1例为ALL。因此EVI1高表达在11q23/MLL重排AML中发生率为43.6%，尽管t（6;11）组和t（9;11）组EVI1表达水平较之正常对照组均有显著增高，且差异有统计学意义，但EVI1基因表达水平在t（6;11）和t（9;11）两组间差异无统计学意义（58.8%对45.4%）。在EVI1高表达AML中，12例（70.59%）为M4/M5，而在EVI1低表达AML中，16例（72.73%）为M4/M5，后者略高于前者，差异无统计学意义。本组病例中t（9;11）AML共11例，其中EVI1低表达者6例，5例（83.33%）为M5，中位白细胞计数为14.28×109/L，而EVI1高表达者5例，3例（60.0%）为M5，中位白细胞计数为46.14×109/L。尽管病例数较少，但似乎与Gröschel等[8]报道一致。EVI1高表达主要见于AML，目前尚未见ALL中EVI1基因高表达的报道，本组8例ALL中1例伴有t（4;11）者为EVI1高表达，因病例数少，故EVI1高表达ALL患者的临床特征尚不清楚。

BRE基因编码DNA损伤修复酶复合物中的亚单位。对11q23/MLL重排急性白血病的基因表达谱研究发现，t（9;11）急性白血病与BRE基因高表达相关。Noordermeer等[9]研究报道，AML中BRE基因高表达发生率为3%左右，且绝大多数发生于11q23/MLL重排AML[10]，尤以t（9;11）异常多见，尚可见于t（10;11）等其他异常，并经统计学分析发现，t（9;11）AML预后良好并不是与易位本身有关，而是与BRE基因高表达有关，BRE高表达t（9;11）AML患者5年生存率明显高于低表达患者（80%对0），因此认为BRE基因高表达为独立的预后良好指标，并建议将BRE基因高表达AML单独列为一种新的亚型。Balgobind等[5]在53例11q23/MLL重排AML中发现19例（35.85%）BRE基因高表达，其中17例（89.47%）为M5，2例为M4。另外，53例AML中，21例为t（9;11）异常，其中15例（71.43%）为BRE基因高表达。因此认为BRE基因高表达与M5及t（9;11）相关。另外，研究者未能在11q23/MLL重排ALL中发现BRE基因高表达，由此推测BRE基因高表达在AML的发生、发展中起着重要作用。

本组39例AML中，12例（30.8%）为BRE高表达，其中9例（75.0%）为M5。同时，39例AML中11例为t（9;11）异常，其中6例（54.6%）为BRE高表达。尽管本组病例数较少，且发生率略低于文献报道，但总体结果一致，即BRE高表达多见于M5和t（9;11）异常。与文献不同的是本组中有3例ALL为BRE基因高表达，且均为t（4;11）异常，因病例数少，其意义尚不明确。

本组中35例死亡，12例存活，中位生存期为10个月。死亡病例中，4例行allo-HSCT。存活的12例中8例患者行allo-HSCT，仅4例行常规化疗。在EVI1高表达组中仅4例存活，均行allo-HSCT，低表达组中8例存活，其中4例行allo-HSCT。BRE高表达组中5例存活，仅1例行allo-HSCT，低表达组中7例存活，均行allo-HSCT。经生存分析发现，EVI1高表达为预后不良因子。统计学分析未能发现BRE高表达与预后良好相关性。对本组病例包括EVI1、BRE基因表达，是否移植等在内的多因素分析发现，除了再次确定EVI1高表达为预后不良因子外，是否移植也为与预后相关的因子，即移植患者预后好于未移植患者，仍未发现BRE高表达与预后良好有关。从本组病例可以看出，allo-HSCT是该类患者获得良好疗效的有效治疗手段。另外，本组病例中t（9;11）组未能体现出较其他类型组更好的预后，可能与本组中行移植病例较少有关。

Noordermeer等[10]报道，在BRE高表达t（9;11）患者中未见EVI1高表达，并认为可以将t（9;11）急性白血病分为更精细的三组，即BRE高表达且EVI1低表达组，该组患者预后良好；BRE低表达且EVI1高表达组，该组患者预后不良；BRE和EVI1均低表达组，该组因病例数较少，预后意义不明。Balgobind等[5]同样发现两种基因表达呈负相关性。我们也对两种基因表达的相关性进行了研究。本组病例中同样未发现EVI1和BRE均高表达病例，可能表明两种基因表达一定程度上互相排斥，但相关性检验未发现显著性负相关。将患者分成与文献一致的三组，但三组之间预后差异无统计学意义。

11例t（9;11）病例组仅见BRE高表达而EVI1低表达和BRE低表达而EVI1高表达两种情况，未见均低表达病例，前组预后好于后组，且差异有统计学意义，与文献报道一致。

目前关于11q23/MLL重排ALL的EVI1及BRE基因表达研究甚少，本组8例ALL中7例为t（4;11），1例为t（6;11），其中两种基因均低表达者4例，BRE高表达而EVI1低表达者3例，1例为EVI1高表达而BRE低表达。因病例数极少，故两种基因的表达在11q23/MLL重排ALL中是否具有独特的特征和意义尚未可知。