第3部：反相、正相、HILIC、离子交换等色谱柱

是指反相分离模式所使用的色谱柱。反相模式所用的凝胶，是在硅胶基材上结合某个官能团组成的。如果用小吃街来形容的话，如果有人出去招揽客人的话那就能更有效的把客人招进店里。官能团就充当类似的招客的工作，官能团中最常用的就是十八烷基。十八烷基是拥有十八个碳的基团，其结构式如下：

此处C表示碳，H表示氢，如果用简单的图形表示则为下列结构。

此外，它有时被称为 C18 基团，而不是十八烷基，因为它有 18 个碳原子。 （最初，octadecyl代表18， octa代表8，deci 代表10）。

在硅胶的表面连接了无数个像这样的碳和氢组成的锁状结构。

虽然结构式看起来非常长，但和硅胶的粒径比起来却是非常微小的，一个硅胶粒子上有无数个这样的基团。这种基团，也附着在硅胶孔隙的表面上。

再拿小吃街来说，每个人对拉客的人的态度也会不同，有些人完全不受影响，有些人就会被招揽进店里。样品被注射器注入色谱柱的时候也一样，根据分子链和各成分的相互作用，各成分从色谱柱中脱出的时间也各不相同。用化学术语来说，这是通过凝胶和样品中成分的亲和力不同进行分离的。这种亲和力有排斥和吸附2种，所以这样的分离模式被称为分配吸附模式。

硅胶作为基质，与十八烷基相结合的凝胶称为ODS（OctaDecylSilica）凝胶。以ODS凝胶填充的色谱柱被称为ODS色谱柱。（也有碳十八柱的叫法，但一般称为ODS柱）。硅胶色谱柱中，大约80%为ODS色谱柱，其占有压倒性优势。

实际上ODS色谱柱中的凝胶并不是全部都和十八烷基结合的，剩余的未能和十八烷基结合的部分被称为硅烷醇基。这种基团的存在会给分离带来一定影响，需要进行封端操作。现在经过封端操作的色谱柱是市场上的主流产品。然而，根据样品的种类不同，也可能有硅烷醇基的情况能得出更好的分析结果，这方面也是HPLC使用过程中的难点。

反相色谱柱中，ODS柱是使用最普遍的。因为十八烷基的分子链很长，效率太高以至于样品在色谱柱中滞留的时间很长，这样会导致测定的时间过长。虽然可以做到很好的分离样品，但是因为时间过长导致实用性变差，这种情况下使用分子链短一些的基团更加有效果。这种官能团有以下几种：

另外，还有使用苯基、氰丙基等官能团和硅胶结合而成的色谱柱。

正如上文所说，虽然反相色谱法使用最广泛的是ODS色谱柱，然而，最近以聚合物为基质的色谱柱也渐渐被使用者接收。一般来说聚合物基质色谱柱有以下几个特点：

虽然聚合物基质色谱柱有1）~3）这样的优点，但是和硅胶柱相比使用频率并没有增多。关于5）价格的问题，聚合物色谱柱的价格也在逐渐降低、如果考虑1）所说明的使用寿命长短的问题，那么聚合柱相对也不那么高价了。最重要的问题是问题4）所说的分离度的问题。最近的聚合物色谱柱性能越来越好，已经向着和硅胶柱相比毫不逊色的方向努力。 Shodex着力于开发反相用的聚合物色谱柱。Shodex的聚合物色谱柱中使用最广泛的是ODP色谱柱。这是聚合物为基质，十八烷基为官能团的OctaDecyl Polymer的缩写。这种命名方式是把ODS色谱柱中Silica的S换成了Polymer的P，非常的好用易懂。

Shodex的反相色谱柱中另一个被广泛使用的是DE-413型色谱柱。这种色谱柱是以聚甲基丙烯酸脂为基材，和别的反相色谱凝胶不同，它的特点是不连接官能团。选择ODP还是DE-413需要根据样品的种类进行判断，请参考Shodex的应用实例。

接着反相色谱柱，说明下正相色谱柱。反相和正相的说明即使从化学来说也是非常复杂的，这里只是把基本的概念做个简单说明。

液相色谱法所用的溶液和凝胶的极性大小都有区别。就用互不相溶的水和油来举例说明，像水这样的物质称为极性大的物质，像油这样的物质称为极性小的物质。不连接官能团的硅胶极性虽然很大，但是连接了十八烷基以后极性就变小了。由碳和氢组成的物质极性很小。像ODS那样硅胶和十八烷基结合的物质极性就很小。另一方面，像水这样由氢和氧组成的物质极性较大。硅胶是在SiO2表面的0原子上连接了氢原子，所以不连接官能团的硅胶极性很大。反相模式，使用极性小的（比如ODS）凝胶作为填料，使用极性大的流动相（比如水和乙腈）。正相模式，使用极性大的（比如硅胶）凝胶作为填料，使用极性小的（己烷、氯仿）等溶剂作为流动相。

另外，除了极性大小的区别，HPLC使用过程中还有亲水性和疏水性的说法。容易溶解于水的也就是极性大的物质亲水性好，容易溶解于油的也就是极性小的物质疏水性好。

液体色谱发展初期，因为在硅胶上结合十八烷基这样的官能团的凝胶还未开发，所以都是使用填充了没有连接官能团的硅胶的色谱柱。总的来说，历史上正相模式先被大众使用，这种模式被称为正相，后来开发的反相模式所利用得原理和正相相反，所以被称为反相模式。

现在反相模式的使用范围比正相多很多，以现在的基准来看，反相模式是比较普遍的方法，然而为了不颠覆历史上的顺序，反相、正相的称呼方法就被定了下来。

正相模式色谱柱使用的填料，除了不连接官能团的硅胶以外，还有连接了丙氨基（NH2）为官能团的硅胶填料。这种连接了丙氨基的色谱柱也称为氨基柱，被广泛运用于糖分析等的正相模式分析中。

HILIC模式全称为亲水相互作用色谱，是分配/吸附模式中较新的分离模式。 HILIC 模式被认为是正相模式之一，因为凝胶表面是高度极性的。填料有硅胶和聚合物基质，并键合各种官能团，例如酰胺基、氨基和氰基。 HILIC 模式中使用如水和乙腈的混合溶液等类似于反相模式的流动相。极性太大而无法在反相模式中保留的高极性物质可以在 HILIC 模式下，利用与反相模式中使用的相似的流动相条件进行分析。 利用此特性，HILIC 模式通常用于糖类分析。Shodex有键合了氨基的聚合物基质NH2P色谱柱。这是以氨基NH2和Polymer的P所组成的命名方法，对于熟悉硅胶基质氨基柱的用户来说非常容易记住。NH2P色谱柱和聚合物基质反相色谱柱一样，和硅胶基质色谱柱相比，有着使用寿命长，耐碱性好等优点。

前面已经说过，反相、正相、HILIC色谱柱统称为分配吸附色谱柱，参照（图-8）能更好的理解色谱柱的性质和选择方法。

图的横坐标是凝胶的极性，越往右极性越小。也就是说，右边的凝胶是反相色谱法使用的填料，左边的凝胶是顺相色谱法所使用的。中间的填料根据场合的不同顺相反相都可以使用。图的纵坐标是凝胶微粒的孔径，根据样品的大小（也可理解为分子量），分子大的样品用孔径大的凝胶，分子小的样品用孔径小的凝胶。比如说，蛋白质是分子非常大的样品，所以必须使用孔径大一点的凝胶。

大家都知道磁铁N极和S极靠近了会互相吸引，N极和N极，S极和S极靠近了会互相排斥。电子中也有类似的作用。+（带正电）和-（带负电）会互相吸引，+和+，-和-则会互相排斥。化学物质可以转化为带点离子的状态。带正电的离子称为阳离子，带负电的离子称为阴离子。

离子交换模式，是利用这种离子间的相互作用进行样品分离的一种方法。和磁石不同的是，磁石的N极永远是N极，S极永远是S极，物质在离子化的溶液中，同样的物质因为周围溶液的关系可以转化为阳离子或阴离子。所以，流动相的性质在逐渐改变，样品中各成分的带电性强弱也各不相同，伴随着流动相性质的改变，各成分也从阳离子变成阴离子（反之亦然），和凝胶的作用由相互吸引转换为了相互排斥。和凝胶相互排斥的成分就从色谱柱中率先脱出，各成分根据离子强弱的顺序从色谱柱中脱出从而达到分离的目的。

离子交换模式通常都使用这种控制流动相的手段来进行分离，像这样流动相的性质渐渐变化的方法称为梯度法。使用梯度法的时候，最常用的是随时间渐渐改变2种流动相溶液的混合比例。如今已经有了泵中内置了有梯度机能的装置。

和梯度法相对的，一般使用的不改变流动相比例的方法称为等度法。

离子交换色谱柱的填料，是将凝胶和阴离子或者阳离子官能团连接组成的。经常使用的官能团有以下几种。

另外，就像先前说的那样，填料用的凝胶都是使用表面开孔的多孔型凝胶，离子交换法也有使用不开孔的小粒径（2.0~2.5μm）凝胶作为填料的情况。这种不开孔的凝胶称作无孔凝胶。无孔凝胶在高速分析（短时间分析）的时候能发挥巨大作用。

离子交换色谱柱既有聚合物基质色谱柱也有硅胶基质色谱柱，流动相条件也有使用碱性流动相的情况。不像在反相的领域硅胶柱占绝大部分占有率，离子交换模式中聚合物色谱柱的使用比例越来越高。离子交换色谱柱被广泛应用于蛋白质，核酸等生物化学领域。

配位体交换色谱柱，使用和离子官能团相结合的凝胶，它的特点是官能团的前端离子是金属离子。这种金属离子称为对离子（或抗衡离子）。

配位体模式，主要用于糖类的分离，利用带正电荷（阳离子化）的金属离子和样品中带负电荷的OH-离子（O和H结合组成的阴离子）的吸引力作用分离。能够通过样品中各成分OH-的数量，OH-的位置不同而加以分离。

可以用来作为对离子的，有钙离子(Ca2＋)、铅离子(Pb2＋)、锌离子(Zn2＋)、钠离子(Na＋)等等。然而，有时单靠配位体交换模式无法分离，和分配吸附色谱还有后面即将说明的离子排阻模式、尺寸排阻模式配合使用就能达到不错的分离效果。

运用离子交换色谱法的时候，是利用阴离子和阳离子的相互吸引力分离样品，离子排阻模式是利用凝胶和样品中各成分的阴离子的排斥力进行分离。 离子排除模式不是单独使用，必须和分配吸附色谱配套使用。它是利用分配吸附色谱模式色谱柱内凝胶对样品成分的保留力，和离子排阻色谱的排斥力中的平衡来达到分离的效果。

离子排除色谱法，经常用于有机酸的分析实验中。